李浩，朱陽(yáng)泉，苗琦

（鎮(zhèn)江市中心血站檢驗(yàn)科，江蘇 鎮(zhèn)江212004）

經(jīng)血傳播是人類免疫缺陷病毒傳播的主要途徑之一，對(duì)無(wú)償獻(xiàn)血者血樣進(jìn)行ELISA和NAT檢測(cè)能有效防止HIV感染。為保障血液安全，本站在對(duì)HIV感染標(biāo)志物采用2次ELISA檢測(cè)的基礎(chǔ)上，自2014年10月起嘗試增加1次NAT檢測(cè)，并從2015年1月1日起對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行2次ELISA檢測(cè)和1次NAT檢測(cè)。現(xiàn)將近四年來(lái)113241份獻(xiàn)血者標(biāo)本檢測(cè)情況進(jìn)行回顧性分析，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 2015年1月-2018年12月鎮(zhèn)江市無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本113241份。

1.2 儀器與試劑 Microlab Star全自動(dòng)加樣儀、FAME24/20全自動(dòng)酶免分析儀（瑞士HAMILTON公司），核酸擴(kuò)增儀ABI7500（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。抗HIV1+2和P24抗原聯(lián)合檢測(cè)試劑（英科廈門(mén)新創(chuàng)），抗HIV1+2檢測(cè)試劑（珠海麗珠），所有試劑批批檢合格，均在有效期內(nèi)，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)操作。NAT檢測(cè)試劑（上海科華生物），室內(nèi)質(zhì)控品由北京康徹斯坦有限公司提供。

1.3 檢測(cè)方法 所有標(biāo)本由不同人員、不同試劑同時(shí)進(jìn)行2次ELISA檢測(cè),合格的標(biāo)本進(jìn)行1次NA T檢測(cè)；2種試劑同時(shí)不合格的標(biāo)本判定為HIV待復(fù)查并送CDC進(jìn)行確證試驗(yàn)；1種試劑檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行雙孔復(fù)試和NAT檢測(cè),如果雙孔復(fù)試陽(yáng)性送CDC。所有NAT檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本送CDC。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各年份不合格率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用SPSS19.0軟件繪制ROC曲線。

2 結(jié)果

2015-2018年本站共檢測(cè)無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本113241份，見(jiàn)表1，其中人類免疫缺陷病毒反應(yīng)性標(biāo)本103例，確證為陽(yáng)性的20例，確證為陰性的81例,不確定性2例,見(jiàn)表2,ELISA雙反應(yīng)性21例,有1例確證為陰性。在確證陰性的81例樣本中，ELISA單反應(yīng)性80例,其S/CO值主要集中在0.5～3之間，見(jiàn)圖1。在確證陽(yáng)性的20例樣本中，ELISA雙反應(yīng)性18例，其S/CO值絕大部分≥6，見(jiàn)圖2。2例NAT反應(yīng)性標(biāo)本經(jīng)跟蹤確認(rèn)為陽(yáng)性。2例不確定樣本因人員流動(dòng)未跟蹤到獻(xiàn)血者。

在送檢CDC的103份有反應(yīng)性標(biāo)本中,經(jīng)確認(rèn)有20份陽(yáng)性,2份不確定性,假陽(yáng)性率高達(dá)78.64%。因2例NAT反應(yīng)性標(biāo)本經(jīng)確證全部為陽(yáng)性，所以過(guò)高的假陽(yáng)性率是由ELISA檢測(cè)導(dǎo)致,其中80例單ELISA+/NAT-確認(rèn)陰性的標(biāo)本,其ELISA結(jié)果S/CO主要分布在0.5～3之間。產(chǎn)生假陽(yáng)性的原因有灰區(qū)設(shè)置過(guò)小、酶標(biāo)板包被物不純、血清中存交叉抗原/抗體、纖維蛋白而產(chǎn)生非特異性反應(yīng)在[1]。本站灰區(qū)S/CO設(shè)置范圍為0.5～1，是否設(shè)置過(guò)嚴(yán)我們做了進(jìn)一步研究。

表1 鎮(zhèn)江市無(wú)償獻(xiàn)血者HIV檢測(cè)結(jié)果比較

表2 抗HIV反應(yīng)性結(jié)果與HIV確認(rèn)結(jié)果比較

圖1 確證為陰性ELISA檢測(cè)結(jié)果(S/CO)分布圖

圖2 確證為陽(yáng)性ELISA檢測(cè)結(jié)果(S/CO)分布圖

依據(jù)EP12-A2,確定抗HIV試驗(yàn)灰區(qū)水平C5~C95。用試劑1根據(jù)EP12-A2文件中推薦的層級(jí)稀釋法尋找C50標(biāo)本,用北京康徹斯坦公司提供的質(zhì)控品進(jìn)行梯度稀釋,重復(fù)檢測(cè)各稀釋濃度的質(zhì)控品8次，得到陰陽(yáng)性比例各占50%的濃度，以此濃度作為C50水平,再對(duì)此濃度質(zhì)控品重復(fù)檢測(cè)40次以驗(yàn)證C50的可靠性（符合EP12-A2中陽(yáng)性數(shù)量應(yīng)為14～26例的要求）。

按照C50濃度,配制體積比C50+20%濃度樣品40例,陽(yáng)性率100%,S/CO均值1.19；C50-20%濃度40例,陰性率100%,S/CO均值0.78。由于檢測(cè)C50±20%兩種濃度陰陽(yáng)性數(shù)均≥95%，所以該濃度包含C5～C95區(qū)間，灰區(qū)范圍S/CO應(yīng)在0.78～1.19之間，見(jiàn)圖3，本實(shí)驗(yàn)室灰區(qū)范圍應(yīng)調(diào)整。

圖3 C50±20%檢測(cè)數(shù)據(jù)曲線圖

繪制ROC曲線圖,選擇2015～2018年試劑1檢測(cè)陰性標(biāo)本46例，反應(yīng)性標(biāo)本56例，其中含灰區(qū)標(biāo)本12例，經(jīng)確證試驗(yàn)陽(yáng)性標(biāo)本19例，以WB實(shí)驗(yàn)為“金標(biāo)準(zhǔn)”，結(jié)果表達(dá)為反應(yīng)性和陰性，以檢測(cè)S/CO值為統(tǒng)計(jì)變量,繪制ROC曲線,見(jiàn)圖4。RO C曲線下面積（AUC）0.984，選擇約登指數(shù)最大截?cái)帱c(diǎn)為最適S/CO值為7.37，大于試劑說(shuō)明書(shū)建議的臨界值S/CO=1。

圖4 ROC曲線圖

3 討論

人類免疫缺陷病毒是血站血液篩查項(xiàng)目之一，輸血是HIV感染的重要傳播途徑，近年來(lái)，相關(guān)報(bào)道顯示HIV檢出率逐年上升[2,3]。我站根據(jù)國(guó)家要求已經(jīng)實(shí)現(xiàn)核酸檢測(cè)全覆蓋，四年中檢出1例ELISA雙試劑陰性而NAT反應(yīng)性并經(jīng)跟蹤確認(rèn)為陽(yáng)性的獻(xiàn)血者，主要因?yàn)楂I(xiàn)血者正處于HIV感染的“窗口期”，這證明了血站開(kāi)展NAT檢測(cè)的重要性，ELISA和NAT檢出具有互補(bǔ)作用[4]。

研究近4年來(lái)獻(xiàn)血者HIV檢測(cè)情況，HIV反應(yīng)性率與HIV確證陽(yáng)性率無(wú)明顯變化，與附近地區(qū)報(bào)導(dǎo)相似[5-7]。血站的血液檢測(cè)工作長(zhǎng)期以來(lái)都以血液安全為重,期望提高檢測(cè)靈敏度以降低輸血風(fēng)險(xiǎn)，ELISA檢測(cè)往往在按照說(shuō)明書(shū)設(shè)置CUTOFF的基礎(chǔ)上又增加了灰區(qū)范圍設(shè)置。靈敏度的提高勢(shì)必導(dǎo)致特異性的降低，灰區(qū)范圍應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自身?xiàng)l件設(shè)置[8]。根據(jù)EP12-A2文件中的方法,我們應(yīng)將灰區(qū)設(shè)定在0.78～1.19倍S/CO之間,本實(shí)驗(yàn)室原設(shè)置的0.5S/CO應(yīng)該調(diào)整。從表2可以看出單ELISA+/NAT-的80例標(biāo)本全部確認(rèn)為陰性。在開(kāi)展NAT檢測(cè)以后，應(yīng)考慮取消灰區(qū)范圍，cutoff值嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)設(shè)置即可。我們進(jìn)一步用ROC曲線尋找ELISA法檢測(cè)抗HIV最適S/CO值，ROC曲線下面積（AUC）0.984說(shuō)明本方法準(zhǔn)確性較高,約登指數(shù)最大的切點(diǎn)對(duì)應(yīng)的最適S/CO=7.37＞1，再次證明無(wú)必要再設(shè)置灰區(qū)。對(duì)于S/CO≥1而NAT陰性的獻(xiàn)血者應(yīng)通過(guò)跟蹤、回訪,送省血液中心再次檢測(cè)決定是否保留歸隊(duì)或屏蔽[9]，目的是盡量保留住更多的獻(xiàn)血者,不能打擊他們的獻(xiàn)血熱情。對(duì)于S/CO≥6的ELISA結(jié)果，尤其是2種ELISA試劑均為陽(yáng)性的標(biāo)本,送檢確認(rèn)陽(yáng)性率較高，應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待，及時(shí)送檢CDC進(jìn)行確認(rèn)。

綜上所述,隨著NAT檢測(cè)在采供血機(jī)構(gòu)的全面覆蓋,能有效縮短HIV“窗口期”，ELISA加NAT的檢測(cè)模式能最大限度的防止陽(yáng)性標(biāo)本的漏檢[10]，然而灰區(qū)設(shè)置會(huì)造成一部分正常血液資源的浪費(fèi)[11]，甚至造成無(wú)償獻(xiàn)血者的流失，給無(wú)償獻(xiàn)血者造成不必要的心理負(fù)擔(dān)。在采用2次ELISA和1次NAT檢測(cè)策略的條件下,可以考慮取消ELISA檢測(cè)HIV灰區(qū)設(shè)置,但這并不能完全消除輸血感染風(fēng)險(xiǎn)，還應(yīng)采取其他措施降低“窗口期”感染風(fēng)險(xiǎn)，比如：從低危人群中招募固定獻(xiàn)血者，做好獻(xiàn)血前的征詢工作，加大HIV防控宣傳，引入更高級(jí)的檢測(cè)技術(shù)等。這樣才能在保證血液安全的基礎(chǔ)上，保留更多的獻(xiàn)血者，避免血液資源的浪費(fèi)。