黃秀芳 原向偉 秦 英 陳忠羨

1.中山大學(xué)附屬江門醫(yī)院（江門市中心醫(yī)院）病理科，廣東江門 529030；2.中山大學(xué)附屬江門醫(yī)院（江門市中心醫(yī)院）脊柱骨科，廣東江門 529030

骨肉瘤是骨組織原發(fā)腫瘤中最常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]，雖然發(fā)病率偏低，但其多發(fā)于青少年，惡性度極高，預(yù)后不佳[2]。順鉑常用于骨肉瘤患者的化療，但因耐藥和毒性作用等問(wèn)題常影響其療效[3-4]。干擾素α（IFN-α）已用于治療多種腫瘤[5-6]，但其對(duì)骨肉瘤化療敏感性的影響罕有報(bào)道。本研究探討IFN-α 對(duì)人骨肉瘤U2OS細(xì)胞化療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與試劑

U2OS 細(xì)胞來(lái)自中山大學(xué)病理學(xué)教研室，培養(yǎng)液為DMEM（GIBCO）[含10%胎牛血清（GIBCO）、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素]，5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。IFN-α 為Peprotech 產(chǎn)品；臺(tái)盼藍(lán)、順鉑購(gòu)自Sigma；Z-VAD-FMK 為Calbiochem 產(chǎn)品；DNAzol 購(gòu)自Invitrogen；Caspase-3（sc-7272）、Caspase-8（sc-56070）、Caspase-9（sc-56077）和GAPDH（sc-47724）等抗體購(gòu)自Santa Cruz。

1.2 臺(tái)盼藍(lán)拒染法

細(xì)胞經(jīng)0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，藍(lán)染為死細(xì)胞，活細(xì)胞拒染，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照組活細(xì)胞數(shù)－實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞數(shù)）/對(duì)照組活細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3 Hoechst 33258 熒光染色

U2OS 細(xì)胞4℃固定10 min 后1000 r/min 離心5 min，加Hoechst 33258 避光染15 min，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞，凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/視野全部細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4 DNA Ladder

U2OS 細(xì)胞加DNAzol，4℃，12 000 r/min 離心15 min，取上清加無(wú)水乙醇4℃，10 000 r/min 離心10 min；加75%乙醇清洗，溶于TE，瓊脂糖凝膠電泳成像。

1.5 Western blot

提取蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，TBST 4℃封閉過(guò)夜；一抗?jié)舛染鶠?∶1000 稀釋，室溫封膜3 h，二抗4℃過(guò)夜，ECL 發(fā)光，Image J 計(jì)算灰度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFN-α 對(duì)順鉑誘導(dǎo)U2OS 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響

IFN-α 組（5000 U/mL）、順鉑組（5 μmol/L）、IFN-α+順鉑組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均高于對(duì)照組，IFN-α+順鉑組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率高于順鉑組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 IFN-α 對(duì)順鉑誘導(dǎo)U2OS 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響（n=3）

2.2 IFN-α 對(duì)順鉑誘導(dǎo)U2OS 細(xì)胞凋亡的影響

對(duì)照組、IFN-α 組細(xì)胞無(wú)明顯凋亡，順鉑組部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡變化如核濃染碎裂等，IFN-α+順鉑組凋亡細(xì)胞明顯增加，見(jiàn)圖2。對(duì)照組、IFN-α 組、順鉑組和IFN-α+順鉑組的細(xì)胞凋亡率分別為（1.63±1.03）%、（4.26±2.19）%、（17.85±3.66）%和（52.55±4.89）%，IFN-α+順鉑組細(xì)胞凋亡率高于順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.02，P<0.01）。

圖2 IFN-α 對(duì)順鉑誘導(dǎo)U2OS 細(xì)胞凋亡的影響（400×）

2.3 聯(lián)合用藥對(duì)DNA 梯形條帶的影響

DNA 梯形條帶是凋亡的特征性表現(xiàn)[7]，與其他組比較，IFN-α+順鉑組出現(xiàn)明顯梯形條帶。見(jiàn)圖3。

圖3 聯(lián)合用藥對(duì)DNA 梯形條帶的影響

2.4 IFN-α 對(duì)順鉑引起Caspase-3、8、9 表達(dá)的影響

在順鉑組，Caspase-3、8、9 僅有微弱的活化，而在IFN-α＋順鉑組，三者均出現(xiàn)明顯的活化裂解。見(jiàn)圖4。與順鉑組比較，IFN-α+順鉑組各活性片段的表達(dá)增加，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表1。

2.5 聯(lián)合用藥的生長(zhǎng)抑制依賴Caspase

經(jīng)泛Caspase 抑制劑Z-VAD-FMK 預(yù)處理后，IFN-α+順鉑+Z-VAD-FMK 組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率低于IFN-α+順鉑組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖5。

圖4 IFN-α 對(duì)順鉑引起Caspase-3、8、9 表達(dá)的影響

3 討論

IFN-α 通過(guò)JAK/STAT 通路發(fā)揮生物學(xué)功能[8-10]，可在胃癌、乳腺癌、肺癌、白血病中引起生長(zhǎng)抑制和凋亡[11-14]，還增強(qiáng)放、化療引起的生長(zhǎng)抑制[15-16]。聯(lián)合生物治療與其他治療，可望達(dá)到“1+1＞2”的療效[17-18]。本研究表明，IFN-α 明顯增強(qiáng)順鉑的生長(zhǎng)抑制，提示了IFN-α 在骨肉瘤治療中的價(jià)值。雖然IFN-α 可抑制耐藥骨肉瘤細(xì)胞[5]，但其僅輕微抑制U2OS 細(xì)胞，這可能因?yàn)镮FN-α 的抑制作用依賴ARF 基因[19]，而U2OS細(xì)胞中ARF 表達(dá)缺失[20]。

IFN-α 和順鉑均可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[21]，因此IFN-α 的增敏作用可能涉及凋亡。形態(tài)學(xué)和DNA ladder 表明IFN-α 的確通過(guò)凋亡增強(qiáng)U2OS 細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。Caspase 是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶[21]，Caspase-8、9 位于起始階段，兩者活化后裂解效應(yīng)性Caspase-3，信號(hào)逐級(jí)傳遞，直至完成凋亡[22-24]。本研究中Caspase-3、8、9 均出現(xiàn)明顯活化，證明IFN-α可能通過(guò)Caspase 級(jí)聯(lián)活化增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的凋亡。而用泛Caspase 抑制劑Z-VAD-FMK 預(yù)處理可顯著減弱該效應(yīng)，表明其依賴于Caspase 的功能。而Caspase通常位于凋亡信號(hào)通路的末端，在其上游，必然存在IFN-α 誘導(dǎo)的起始因子改變，STAT 基因家族是候選因子之一[8]，相關(guān)研究尚需進(jìn)一步深入。

表1 各組活化Caspase 蛋白的灰度分析（n=3）

圖5 聯(lián)合用藥的生長(zhǎng)抑制依賴Caspase（n=3）

目前骨肉瘤仍缺乏有效的治療新方法[25]，IFN-α通過(guò)Caspase 依賴性凋亡增強(qiáng)骨肉瘤U2OS 細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，提示聯(lián)合IFN-α 與傳統(tǒng)化療可能獲得更好的效果，相關(guān)研究值得進(jìn)一步開(kāi)展。