葉勇強，劉勝華，田必正，何 森，郝建強，謝 飛△

1.四川省資陽市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，四川資陽 641300；2.四川省三臺縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科，四川綿陽 621100；3.重慶市銅梁區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，重慶 402560

神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤種類較多，而神經(jīng)上皮組織腫瘤在臨床上發(fā)病率最高，并且其分類及分型較為復雜，神經(jīng)膠質(zhì)瘤就是其中一種，膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)膠質(zhì)細胞，包括星形細胞腫瘤、少突膠質(zhì)細胞腫瘤及混合性膠質(zhì)細胞腫瘤等，惡性度較高[1-2]。腦膜瘤多位于大腦矢狀竇和凸面旁，易導致偏癱等神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀,病程較短,且水腫明顯[2-3]。三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白G超家族成員2(ABCG2)是膜轉(zhuǎn)運體ABC超家族成員，近年來被發(fā)現(xiàn)與多種良惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在潛在關(guān)聯(lián)，且其還參與了腫瘤的耐藥[4]。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-2(IGFBP-2)主要通過非胰島素樣生長因子依賴性和胰島素樣生長因子依賴性發(fā)揮生物學功能，能夠調(diào)節(jié)細胞增生、血管生成及細胞遷移，與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[5-6]。本研究針對膠質(zhì)瘤與腦膜瘤患者腫瘤組織ABCG2、IGFBP-2表達差異展開分析，并圍繞其對預后評價的臨床意義進行對比研究。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2018年6月在資陽市第一人民醫(yī)院確診為膠質(zhì)瘤患者96例(膠質(zhì)瘤組)及惡性腦膜瘤患者38例(惡性腦膜瘤組)作為受試對象。膠質(zhì)瘤組中男54例，女42例；年齡為38～75歲，平均(56.57±18.32)歲。惡性腦膜瘤組中男23例，女15例；年齡為50～87歲，平均(68.45±17.93)歲。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。全部患者隨訪1年。納入標準：(1)臨床資料、病理學檢查確診為膠質(zhì)瘤及惡性腦膜瘤的受試對象均于資陽市第一人民醫(yī)院接受手術(shù)治療；(2)在接受本研究前未接受過特殊的化療及放療；(3)接受本研究時不伴有顱腦外傷；(4)無其他長期的神經(jīng)內(nèi)科相關(guān)疾病病史。排除標準：(1)同時罹患其他器官系統(tǒng)惡性腫瘤或其他神經(jīng)系統(tǒng)良惡性腫瘤及炎癥；(2)各種原因不能配合本次研究及隨訪。所有患者及其家屬均知情同意，并簽署知情同意書。本研究經(jīng)資陽市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準通過。

1.2儀器與試劑 鼠抗人ABCG抗體(美國Abcam生物公司，產(chǎn)品批號A-AJ1006a);IGFBP-2免疫組化試劑盒(福建中杉金橋生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)REE-001);光學顯微鏡(北京世科信科學儀器有限公司，XSP-100SM)。

1.3方法 受試對象均接受手術(shù)治療，術(shù)中留取腫瘤組織標本，采用免疫組化法檢測96例膠質(zhì)瘤患者和38例惡性腦膜瘤患者標本中ABCG2、IGFBP-2陽性細胞的表達，計算其陽性細胞百分率并劃分等級。免疫組化法檢測ABCG2蛋白表達水平。取制作好的4 μm組織切片，首先經(jīng)二甲苯脫蠟后，以梯度乙醇脫水，自來水沖洗后磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗，滴加抗原修復液0.01 mol/L、pH6.0的檸檬酸緩沖液，自然冷卻后用PBS沖洗；以過氧化氫滴加，用來阻斷內(nèi)源性過氧化物酶15 min；用PBS沖洗后滴加20%正常羊血清室溫下封閉30 min，傾去血清加鼠抗人ABCG抗體，工作濃度1∶30；按說明書完成測定，并進行結(jié)果判定。ABCG2的免疫結(jié)果判定：ABCG2主要在細胞膜表達，以細胞膜出現(xiàn)棕黃色高出背景色為陽性細胞。隨機選取5個高倍視野，進行陽性、陰性細胞計數(shù)，陽性細胞百分率=陽性細胞數(shù)/(陽性細胞數(shù)+陰性細胞數(shù))×100%。陽性級別分為3個等級：Ⅰ級陰性，陽性細胞百分率為0%；Ⅱ級陽性，陽性細胞百分率為>0%～10%；Ⅲ級強陽性，陽性細胞百分率>10%。

IGFBP-2檢測嚴格按照免疫組化試劑盒說明書進行操作，方法同上。一抗為羊抗人 IGFBP-2單克隆抗體(美國Santa Cruz生物技術(shù)公司)，工作濃度1∶400。在4 ℃下進行孵育過夜，用S-P即用型試劑盒染色。在光鏡(北京世科信科學儀器有限公司，XSP-100SM)下出現(xiàn)胞質(zhì)和胞膜粗細一致的棕黃色顆粒即為陽性。每張切片隨機觀察3個高倍鏡視野，分別計數(shù)100個細胞，通過陽性腫瘤細胞的百分率分級：Ⅰ級陰性，見極少或無陽性腫瘤細胞(0%～<10%)；Ⅱ級陽性(+)，陽性細胞百分率10%～<30%；Ⅲ級陽性(++)，陽性細胞百分率30%～<60%；Ⅳ級強陽性(+++)，陽性細胞百分率≥60%。將ABCG2陰性和陽性患者作為低表達ABCG2組，將ABCG2強陽性患者作為高低表達ABCG2組。將IGFBP-2陰性和陽性(+)患者作為低表達IGFBP-2組，將IGFBP-2陽性(++)和強陽性(+++)患者作為高表達IGFBP-2組。研究隨訪受試對象1年，收集期間預后復發(fā)率和病死率，分析其與分級的相關(guān)性。并收集患者出現(xiàn)不良事件(死亡、神經(jīng)功能中度缺損)的情況。

2 結(jié) 果

2.1受試對象腫瘤組織ABCG2、IGFBP-2表達分布 膠質(zhì)瘤患者與惡性腦膜瘤患者ABCG2的表達分布具有相似性，主要分布于腫瘤細胞的細胞膜，胞質(zhì)也有少部分表達，為棕黃色，陽性表達細胞有沿血管分布的傾向，級別越高，陽性表達細胞越多。見圖1。膠質(zhì)瘤患者與惡性腦膜瘤患者IGFBP-2表達分布也具有相似性，在胞質(zhì)和胞膜均有表達，為棕黃色，級別越高，陽性表達細胞越多。見圖2。

注:A為膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中ABCG2陰性免疫組化結(jié)果，B為膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中ABCG2陽性免疫組化結(jié)果，C為膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中ABCG2強陽性免疫組化結(jié)果；a為惡性腦膜瘤患者腫瘤組織中ABCG2陰性免疫組化結(jié)果，b為惡性腦膜瘤患者腫瘤組織中ABCG2陽性免疫組化結(jié)果，c為惡性腦膜瘤患者腫瘤組織中ABCG2強陽性免疫組化結(jié)果。

注:A為膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中IGFBP-2陰性免疫組化結(jié)果，B為C為膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中IGFBP-2陽性(+)免疫組化結(jié)果，C為膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中IGFBP-2陽性(++)免疫組化結(jié)果，D為膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中IGFBP-2強陽性(+++)免疫組化結(jié)果；a為惡性腦膜瘤患者腫瘤組織中IGFBP-2陰性免疫組化結(jié)果，b為惡性腦膜瘤患者腫瘤組織中IGFBP-2 Ⅱ級陽性(+)免疫組化結(jié)果，c為腦膜瘤患者腫瘤組織中IGFBP-2陽性(++)免疫組化結(jié)果，d為腦膜瘤患者腫瘤組織中IGFBP-2強陽性(+++)免疫組化結(jié)果。

2.2兩組腫瘤組織ABCG2、IGFBP-2陽性細胞百分率及分級比較 膠質(zhì)瘤組腫瘤組織ABCG2、IGFBP-2總陽性率與惡性腦膜瘤組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組腫瘤組織ABCG2、IGFBP-2陽性細胞百分率及分級比較[n(%)]

2.3兩組隨訪預后情況比較 膠質(zhì)瘤組隨訪中復發(fā)率和病死率與惡性腦膜瘤組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組隨訪預后情況比較[n(%)]

進一步分析兩組患者腫瘤組織ABCG2、IGFBP-2表達與預后之間的關(guān)聯(lián)，兩組患者均可見與ABCG2、IGFBP-2表達陰性者比較，隨著陽性細胞百分率的增加，患者復發(fā)率與病死率也逐級升高。見表3、4。

表3 兩組腫瘤組織ABCG2、IGFBP-2表達與復發(fā)預后之間關(guān)系

表4 兩組腫瘤組織ABCG2、IGFBP-2表達與病死預后之間關(guān)系

續(xù)表4 兩組腫瘤組織ABCG2、IGFBP-2表達與病死預后之間關(guān)系

2.4兩組患者不同ABCG2、IGFBP-2表達分布對預后的生存曲線分析 隨訪過程中，ABCG2高表達患者出現(xiàn)不良事件(死亡、神經(jīng)功能中度缺損)的時間提前于ABCG2低表達患者(χ2=13.660，P<0.05)。見圖3。隨訪過程中，IGFBP-2高表達患者出現(xiàn)不良事件(死亡、神經(jīng)功能中度缺損)時間提前于IGFBP-2低表達患者(χ2=19.266，P<0.05)。見圖4。

圖3 不同ABCG2表達組患者預后情況的生存曲線

圖4 不同IGFBP-2表達組患者預后情況的生存曲線

3 討 論

膠質(zhì)瘤與惡性腦膜瘤在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤病理變化基礎(chǔ)存在相似性，但治療與預后不盡相同，臨床上需注意鑒別診斷[7-8]。ABCG2作為一種轉(zhuǎn)運蛋白，其表達和功能發(fā)揮與體內(nèi)外環(huán)境因素密切關(guān)聯(lián)，隨著干細胞研究的深入，不少研究發(fā)現(xiàn)，其參與了干細胞特性S-P表型的形成，而且與多種惡性腫瘤的發(fā)生及腫瘤干細胞的多藥抗性密切聯(lián)系[9-10]。ABCG2也可使腦腫瘤干細胞處于未分化狀態(tài),從而促使膠質(zhì)瘤的惡性增殖[11]。同時，通過ABCG2轉(zhuǎn)運蛋白的功能排除有害物質(zhì)對腫瘤干細胞的傷害，對這類細胞也具有保護作用[12]。IGFBP-2在腦中的合成部位主要位于脈絡(luò)叢及微血管系統(tǒng)中[13-14]。多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤患者均可見IGFBP-2表達上調(diào)，腦脊液中 IGFBP-2可作為診斷惡性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的一個特異性標志物。此外，IGFBP-2 陽性表達與腫瘤的惡性程度相關(guān),可以提示腫瘤，特別是膠質(zhì)瘤的惡性發(fā)展過程[15]。

近年來，已有研究發(fā)現(xiàn)ABCG2可能會影響成年人短期和長期記憶、精神運動功能、睡眠質(zhì)量和情緒[14]。而在膠質(zhì)瘤患者中，當其遇到壓力或情緒事件時，應激反應激活藍斑神經(jīng)元，導致ABCG2與杏仁核協(xié)同促進去甲腎上腺素能系統(tǒng)在海馬體中的釋放，從而加強了記憶形成。而IGFBP-2阻斷了去甲腎上腺素與杏仁核、海馬內(nèi)β腎上腺素能受體的結(jié)合，從而影響這兩個區(qū)域的功能[5]。高級神經(jīng)功能是神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤預后觀測的重要指標，ABCG2和IGFBP-2可以有效影響患者的記憶、情感等功能。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤和惡性腦膜瘤組織中ABCG2和IGFBP-2其分布具有相似性，ABCG2多分布于細胞膜，且陽性細胞多沿血管分布，IGFBP-2多分布于細胞質(zhì)和細胞膜中。膠質(zhì)瘤組腫瘤組織ABCG2、IGFBP-2總陽性率與惡性腦膜瘤組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這可能與惡性腦膜瘤的侵襲性遠低于神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤有關(guān)。生存分析曲線結(jié)果顯示，ABCG2、IGFBP-2高表達患者出現(xiàn)預后不良事件的時間普遍提前(P<0.05)。研究表明，ABCG2在膠質(zhì)瘤中的表達隨著腫瘤惡性程度的升高而逐漸上調(diào)，IGFBP-2 的表達在膠質(zhì)瘤和其他腫瘤類型中隨著腫瘤級別的增高而上調(diào)[16-19]。本研究同樣證實了這點，在ABCG2和IGFBP-2陽性細胞百分率較高的患者中，其腫瘤惡性程度可能也比較高，復發(fā)和病死情況也較多。提示隨著ABCG2和IGFBP-2陽性細胞百分率的增加，膠質(zhì)瘤和惡性腦膜瘤患者的預后均更差。本研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2和IGFBP-2對術(shù)前膠質(zhì)瘤和惡性腦膜瘤的惡性程度具有預測價值，并聯(lián)合影像學檢查綜合判斷，有助于術(shù)中對病變性質(zhì)、切除范圍大小的判斷，對臨床早期評估預后具有一定作用，但其具體的生物學功能和機制尚有待進一步研究，可延長隨訪時間，增加樣本量，對ABCG2和IGFBP-2兩項指標的遠期預測效能進行評估，減少混雜因素的影響，以期更進一步說明ABCG2和IGFBP-2兩項指標的預測價值。