陳慧，郭亞男，余祖江

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 感染科，河南 鄭州 450052；2.鄭州市中心醫(yī)院 感染性疾病科，河南 鄭州 450007)

在我國原發(fā)性肝癌發(fā)病率在惡性腫瘤中排名第4位，占癌癥相關(guān)死亡原因第3位[1]，在全世界惡性腫瘤發(fā)病率中位于第6位[2]。原發(fā)性肝癌由肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)和HCC-ICC混合癌組成，其中HCC所占比例最高，為85%～90%。病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、黃曲霉毒素污染食物引起的慢性損傷性肝炎等經(jīng)過長期慢性炎癥刺激，可發(fā)展為肝硬化和肝癌。甲胎蛋白作為臨床上最常見的肝癌腫瘤標(biāo)志物，廣泛應(yīng)用于原發(fā)性肝癌的輔助診斷、療效評估和復(fù)發(fā)監(jiān)測，由于其敏感性和特異性仍存在一定不足等原因[3-4]，大多數(shù)肝癌確診時(shí)已為晚期。隨著基因?qū)W及生物信息學(xué)的發(fā)展，為進(jìn)一步改善肝癌早期確診率和早期治療率、延長患者生存時(shí)間，探索新的肝癌腫瘤標(biāo)志物十分必要。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多方面的變化，包括遺傳和表觀改變的積累[5]。啟動子甲基化的表觀遺傳調(diào)控在腫瘤形成中有著重要作用[6]。此外，DNA表觀遺傳失調(diào)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可用于癌癥的輔助診斷或預(yù)后標(biāo)記。本研究從癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫獲取原發(fā)性肝癌甲基化數(shù)據(jù)及基因表達(dá)數(shù)據(jù)，聯(lián)合分析篩選出可能為肝癌腫瘤標(biāo)志物的RBM15B(the RNA binding motif protein 15B)。RBM15B分子是SPEN(split end)家族中的一員，為RNA結(jié)合蛋白。RBM15B蛋白含有3個(gè)RNA識別基序，位于N端半部，分為1個(gè)核定位信號，以及1個(gè)裂和C-末端結(jié)構(gòu)域，共同介導(dǎo)甲狀腺受體轉(zhuǎn)錄沉默介質(zhì)、維甲酸及核受體輔抑制子之間的相互作用[7]，該分子在肝癌中作用尚不明確，為研究該分子與肝癌的關(guān)系，本研究在mRNA水平上利用數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析其在HCC中的表達(dá)水平及對預(yù)后的評估價(jià)值，再通過組織芯片技術(shù)從蛋白水平檢測RBM15B在HCC中的表達(dá)情況，探討RBM15B是否可以作為HCC的腫瘤標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 通過TCGA數(shù)據(jù)庫篩選潛在的肝癌腫瘤標(biāo)志物1.1.1從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載、過濾相關(guān)數(shù)據(jù) 從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載原發(fā)性肝癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)(RNA-Seq)和啟動子甲基化數(shù)據(jù)，將RNA-Seq與甲基化譜中都有的癌與癌旁樣本進(jìn)行匹配，共得到41個(gè)肝癌患者的癌與癌旁組織樣本數(shù)據(jù)。將RNA-Seq數(shù)據(jù)從FPKM格式轉(zhuǎn)換成TPM數(shù)據(jù)，定義基因TSS區(qū)上游800 bp到下游200 bp區(qū)間為啟動子區(qū)域，用探針處理相應(yīng)的啟動子甲基化區(qū)域，將空載的探針去除，當(dāng)有多個(gè)探針對應(yīng)到同一基因區(qū)域時(shí)，取平均值作為該基因的啟動子甲基化表達(dá)水平，共得到17 937個(gè)啟動子甲基化的基因供后續(xù)研究。

1.1.2篩選低啟動子甲基化高表達(dá)基因(epigenetically induced，EI)和高啟動子甲基化低表達(dá)基因(epigenetically suppressed，ES) 在配對的癌與癌旁組織中每個(gè)基因的表達(dá)中位數(shù)之比為差異倍數(shù)(fold chang)，進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，選擇P<0.05和∣log2(fold change)∣>1的基因作為表達(dá)差異基因，P<0.05的作為啟動子甲基化差異基因。進(jìn)一步整合表達(dá)上調(diào)基因與啟動子甲基化下調(diào)基因和表達(dá)下調(diào)基因與啟動子甲基化上調(diào)基因，得到互斥模式的EI和ES基因，其中EI基因共1 177個(gè)，ES基因共165個(gè)。

1.1.3篩選潛在腫瘤標(biāo)志物 計(jì)算每一個(gè)EI和ES基因與其啟動子甲基化之間的相關(guān)系數(shù)，共419個(gè)EI基因和68個(gè)ES基因與其啟動子甲基化呈負(fù)相關(guān)。隨后，從HIPPIE數(shù)據(jù)庫中下載人類蛋白互作數(shù)據(jù)，以此建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，將上述EI和ES基因全部映射到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，最終構(gòu)建出EI/ES互作子網(wǎng)。有436個(gè)基因映射至網(wǎng)絡(luò)中，彼此互作的基因有315個(gè)。計(jì)算EI/ES互作網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)基因互作的EI和ES基因個(gè)數(shù)，以此構(gòu)建統(tǒng)計(jì)學(xué)模型。計(jì)算出每個(gè)基因EI和ES富集情況，將富集顯著性P值的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)小于0.05的基因作為EI/ES調(diào)控子網(wǎng)中表達(dá)特異基因。

1.2 多數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證RBM15B在肝癌組織中的表達(dá)差異及預(yù)后分析下載TCGA數(shù)據(jù)庫、LIRIJP數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫中6個(gè)數(shù)據(jù)集(GSE45436、GSE54236、GSE54238、GSE57957、GSE60502、GSE84005)中癌與癌旁RBM15B mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)及其匹配的隨訪資料，利用R語言工具進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾及處理，比較癌與癌旁組織中RBM15B mRNA表達(dá)差異。將TCGA數(shù)據(jù)庫中的RBM15B mRNA按表達(dá)水平分為高表達(dá)和低表達(dá)兩組，繪制生存曲線，比較兩組總體生存(overall survival，OS)和無進(jìn)展生存(progress free survive，PFS)情況，再按肝癌TNM分期分為TNM 1～2和TNM 3～4兩組，比較兩組RBM15B mRNA表達(dá)水平。

1.3 HCC組織芯片中RBM15B蛋白表達(dá)分析收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院HCC組織和配對的癌旁正常組織100對。對組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，經(jīng)過脫苯、脫蠟、抗原修復(fù)等步驟，加兔抗人RBM15B一抗(購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號為22249-1-AP，按1∶200稀釋)，室溫孵育2 h，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗片后加入羊抗兔二抗(購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號為SA00001-2)并室溫孵育1 h，最后用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)溶液顯示信號。陽性細(xì)胞呈棕黃色著色，結(jié)果由兩位病理科醫(yī)生以盲法共同判讀，依據(jù)Remmele評分系統(tǒng)，在每份癌或癌旁標(biāo)本中選擇3個(gè)高倍視野，按染色區(qū)域百分比的平均數(shù)進(jìn)行評分，<25%、25%～<50%、50%～<75%、≥75%分別為1+、2+、3+、4+級。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用R和GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)，當(dāng)不滿足兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)前提時(shí)采用秩和檢驗(yàn)；兩配對樣本采用配對t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果根據(jù)肝癌基因表達(dá)與甲基化數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析，同時(shí)聯(lián)合人類蛋白互作數(shù)據(jù)，篩選得到EI/ES基因互作子網(wǎng)中4個(gè)表達(dá)特異基因，分別為RBM15B(P=6.09×10-5，F(xiàn)DR=1.21×10-2)、TIPIN(P=3.06×10-5，F(xiàn)DR=6.15×10-3)、DUSP28(P=2.88×10-5，F(xiàn)DR=5.81×10-3)和TRIM31(P=1.66×10-4，F(xiàn)DR=3.29×10-2)。在EI/ES互作子網(wǎng)中，RBM15B的互作基因個(gè)數(shù)最多，共有31個(gè)，提示在細(xì)胞多個(gè)生命活動中，RBM15B可與多個(gè)蛋白相互作用。

2.2 多個(gè)數(shù)據(jù)庫中RBM15B在肝癌中的表達(dá)及預(yù)后分析

2.2.1表達(dá)差異分析 TCGA和LIRIJP數(shù)據(jù)庫資料分析結(jié)果顯示，癌組織中RBM15B mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織(P<0.001)；在大多數(shù)GEO數(shù)據(jù)集中，RBM15B mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織(P<0.01)，少數(shù)GEO數(shù)據(jù)集中兩者表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

ns表示P>0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2.2.2預(yù)后分析 RBM15B mRNA高表達(dá)組中位OS(P=0.005)和中位PFS(P<0.001)均短于低表達(dá)組，見圖2、3。TNM 3～4組RAM15B mRNA表達(dá)水平高于TNM 1～2組(P=0.008)，見圖4。

2.3 HCC組織芯片中RBM15B蛋白表達(dá)水平HCC組織中RBM15B蛋白表達(dá)水平高于癌旁組織(P<0.001)，見表1和圖5。

圖2 RBM15B mRNA高表達(dá)組與低表達(dá)組總體 生存期(OS)比較

圖3 RBM15B mRNA高表達(dá)組與低表達(dá)組 無進(jìn)展生存期(PFS)比較

圖4 TNM 1～2組與TNM 3～4組RAM15B mRNA 表達(dá)水平比較

表1 HCC及癌旁正常組織中RBM15B蛋白表達(dá)水平比較

左側(cè)為癌旁正常組織，右側(cè)為HCC組織。

3 討論

DNA甲基化通過甲基化轉(zhuǎn)移酶將CG核苷酸胞嘧啶催化成5-甲基胞嘧啶，從而實(shí)現(xiàn)表觀遺傳調(diào)控。DNA甲基化功能失調(diào)會引起癌基因活化及抑癌基因失活，故DNA甲基化異常通常作為惡性腫瘤的特征之一[8-9]。相比于基因突變，表觀調(diào)控具有可逆性，這使得DNA甲基化在惡性腫瘤中可作為潛在的治療靶點(diǎn)[10]。以往有研究表明，異常的DNA甲基化與肝癌的發(fā)生、診斷、治療和預(yù)后有著密切聯(lián)系[11-12]。DLC-1(deleted in liver cancer 1)基因編碼腫瘤抑制因子，而DNA甲基化常導(dǎo)致肝癌中DLC-1基因缺失。DNA甲基化還會干擾多種重要基因的表達(dá)，包括多腫瘤抑制因子1、RAS關(guān)聯(lián)域家族1A、細(xì)胞因子信號抑制因子1和人類Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3，上述基因的異常共同導(dǎo)致了肝癌的發(fā)生[13]。此外，BMP4(bone morphogenetic protein 4)作為甲基化的生物標(biāo)志物，已被用于預(yù)測肝癌切除術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[14]。上述研究均表明異常的DNA甲基化在促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了協(xié)調(diào)作用，同時(shí)DNA甲基化生物標(biāo)志物也可能成為肝癌診斷和治療的靶點(diǎn)。

為進(jìn)一步提高肝癌的早期診斷率與治療率，研究人員一直在探尋理想的腫瘤標(biāo)志物?；虮磉_(dá)差異分析法被用來尋找腫瘤標(biāo)志物時(shí)間已久，但聯(lián)合DNA甲基化分析探尋腫瘤標(biāo)志物相關(guān)研究卻很少。本研究結(jié)合基因表達(dá)與DNA甲基化數(shù)據(jù)，進(jìn)行聯(lián)合分析，篩選出可能作為肝癌腫瘤標(biāo)志物的RBM15B。RBM15B最初被鑒定為愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)mRNA輸出因子的結(jié)合伴侶[7,15]，曾被報(bào)道經(jīng)常伴隨嬰兒急性巨核細(xì)胞白血病基因分型t(1；22)(p13;q13)的5’易位[16]，RNA干擾降低RBM15B表達(dá)水平后可抑制慢性髓系白血病細(xì)胞的生長和增殖，阻斷細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡，RBM15B的表達(dá)水平對慢性髓系白血病細(xì)胞的存活起著關(guān)鍵作用[17]。RBM15B也曾被報(bào)道參與多種實(shí)體瘤的演化過程，比如Zhang等[18]通過下一代高通量測序在原發(fā)性上皮性卵巢癌組織中發(fā)現(xiàn)RBM15B至少存在2個(gè)突變了的可能的致癌位點(diǎn)，Shahriyari等[19]發(fā)現(xiàn)與RBM15B的表達(dá)呈高度正相關(guān)的BPA1(BRCA1 associated protein-1)是葡萄膜黑色素瘤和乳腺癌的預(yù)后基因，另外，RBM15B還與惡性間皮瘤、腎透明細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[20-21]。為進(jìn)一步探究RBM15B與肝癌的關(guān)系，本研究從多個(gè)數(shù)據(jù)庫收集數(shù)據(jù)分析了RBM15B在癌與癌旁組織、不同TNM分期患者中的表達(dá)情況，并從mRNA層面證實(shí)了RBM15B的表達(dá)量在HCC中升高，且具有預(yù)后評估價(jià)值，最后通過組織芯片技術(shù)在蛋白層面分析RBM15B的表達(dá)，再次驗(yàn)證RBM15B在肝癌組織中高表達(dá)。

綜上所述，RBM15B很可能參與并促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展，且具有一定的預(yù)后評估價(jià)值，是肝癌潛在的預(yù)測指標(biāo)和精準(zhǔn)治療靶點(diǎn)。