張丹 潘思影 張會(huì)峰 尚進(jìn)

(1鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，河南 鄭州 450064；2河南省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科；3鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科)

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的慢性代謝性疾病之一〔1,2〕。機(jī)體長(zhǎng)期的慢性高血糖耐受會(huì)誘導(dǎo)機(jī)制脂質(zhì)和蛋白代謝紊亂，進(jìn)而誘發(fā)多種腎臟、心血管等多組織并發(fā)癥，進(jìn)而對(duì)人體健康、壽命、生活質(zhì)量等構(gòu)成嚴(yán)重威脅。近來(lái)有研究表明，糖尿病是一種自身免疫性和慢性炎癥性疾病；長(zhǎng)期的高血糖會(huì)引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激、炎癥等多種病理性變化〔3～5〕。因此，糖尿病相關(guān)的炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)研究已經(jīng)成為糖尿病治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。雖然西藥在血糖控制方面具有顯著療效；但是長(zhǎng)期使用化學(xué)藥物不僅會(huì)使得患者產(chǎn)生耐藥性，還會(huì)造成惡心、厭食、肝腎功能損傷等多種毒副作用，且價(jià)格昂貴。然而，中藥在糖尿病的治療過(guò)程中具有悠久歷史，能夠顯著改善糖尿病患者機(jī)體狀況，并能夠顯著改善患者的并發(fā)癥和毒副作用〔6～9〕。因此，中藥在糖尿病的治療中具有非常廣闊的前景。例如，文獻(xiàn)表明芒果苷和苦瓜果汁等能夠顯著改善鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠體重降低、血糖和自由基升高，并能夠顯著改善機(jī)體血脂，具有抗炎、增強(qiáng)免疫等多種藥理活性〔10～11〕。番茄紅素是從茄科植物提取出來(lái)的一種非常重要的類(lèi)胡蘿卜素，其具有抗糖尿病作用，但是作用機(jī)制仍不清楚。因此，本研究通過(guò)番茄紅素處理糖尿病大鼠8 w后，檢查糖尿病大鼠體重及血糖等指標(biāo)的變化，并測(cè)定機(jī)體氧化應(yīng)激及炎癥因子相關(guān)指標(biāo)，探究番茄紅素抗糖尿病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體重為(220±20)g，均由河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供〔SYXK(豫)2017-0006〕。實(shí)驗(yàn)大鼠均飼養(yǎng)恒溫(25℃)、恒濕(50%±5%)環(huán)境下統(tǒng)一飼養(yǎng)〔SYXK(豫)2017-0021〕，并且保證動(dòng)物飼養(yǎng)間通風(fēng)、干燥，晝夜12 h循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及操作均經(jīng)過(guò)河南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，倫理審查編號(hào)：LACUC-20170106025。本實(shí)驗(yàn)操作遵循3R原則。

1.2主要試劑與儀器 番茄紅素和STZ均購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Sigma 公司(美國(guó))；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-6試劑盒均購(gòu)買(mǎi)自北京索萊寶科技有限公司(北京，中國(guó))；核因子(NF)-κB p-65、p-核因子-κB抑制劑激酶(IKK)β、核因子(IKK)β、p-IκBα和IκBα一抗、熒光二抗購(gòu)買(mǎi)自大連 Takara 公司(大連，中國(guó))。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)買(mǎi)自南京建成生物科技公司(南京，中國(guó))。

低溫離心機(jī)(Allegra X-30R，Beckman，美國(guó))；CX41熒光顯微鏡(德國(guó)Olympus公司)；RM22335型石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；酶標(biāo)儀(iMark，Bio-Rad，美國(guó))。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物模型的制備 實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)1 w后，開(kāi)始給予高脂、高糖飲食連續(xù)8 w后，腹腔注射給予STZ〔60 mg/(kg·d)〕連續(xù)2 d，以制備糖尿病大鼠模型〔12〕。并分別在72 h和3 d后測(cè)定試驗(yàn)大鼠的空腹血糖，當(dāng)實(shí)驗(yàn)大鼠空腹血糖持續(xù)高于16.7 mmol/L時(shí)，表明糖尿病實(shí)驗(yàn)大鼠模型復(fù)制成功。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將造模成功的試驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組(n=15)：模型組、番茄紅素低劑量組(15 mg/kg)和番茄紅素高劑量組(30 mg/kg)。另取15只健康大鼠作為正常組。分組后，正常組試驗(yàn)大鼠和模型組試驗(yàn)大鼠通過(guò)灌胃給予相應(yīng)的生理鹽水，而給藥組則通過(guò)灌胃給予相應(yīng)劑量的番茄紅素，連續(xù)給予8 w。

1.3.3血清生化指標(biāo)的測(cè)定 連續(xù)給藥8 w后，測(cè)定實(shí)驗(yàn)大鼠的體重和空腹血糖；然后采用水合氯醛將試驗(yàn)大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，室溫放置1 h后，在4℃、3 000 r/m條件下離心15 min；取上清，用于測(cè)定SOD、GSH-Px、CAT酶活力與MDA含量及血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平變化；在所有生化指標(biāo)的檢測(cè)過(guò)程中，所有操作嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性與可重復(fù)性。

1.3.4HE染色觀察試驗(yàn)大鼠腎臟組織形態(tài)變化 每組試驗(yàn)大鼠取3只，經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，采用4%多聚甲醛溶液(PFA)進(jìn)行灌流，取出腎臟組織，4% PFA固定24 h后，經(jīng)脫水處理后進(jìn)行常規(guī)的包埋、切片，厚度約4 μm。進(jìn)行常規(guī)HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組實(shí)驗(yàn)大鼠腎臟組織的病理學(xué)變化。

1.3.5Western印跡檢測(cè)腎臟組織中相關(guān)蛋白的表達(dá) 稱(chēng)取適量腎臟組織，加入組織裂解液，在冰浴上放置2 h，然后在4℃、3 500 r/min條件下離心10 min后取上清；并按照BCA法測(cè)定各組織提取液中的蛋白濃度。然后加入緩沖鹽溶液，沸水浴加熱10 min使得蛋白變性；然后進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)以分離目的蛋白，然后將其轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在搖床上采用TBST洗膜5 min×3次，然后采用5%的胎牛血清(BSA)封閉2 h后加入相應(yīng)的一抗，并保持在避光、4℃的條件下孵育過(guò)夜；在采用TBST洗膜5 min×3次。然后，加入熒光二抗在避光、4℃的條件下孵育2 h。在采用TBST洗膜5 min×3次后，使用Image Studio軟件分析目的蛋白的相對(duì)灰度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1一般狀況及血糖、腎臟指數(shù)的變化 正常組試驗(yàn)大鼠的精神狀態(tài)良好，飲食、飲水量正常，皮膚毛色有光澤；而模型組大鼠精神萎靡，出現(xiàn)了明顯的“三多一少”的臨床特征，并且毛色干枯、稀疏；當(dāng)給予番茄紅素后，其精神狀態(tài)、毛色和日常的飲食、飲水量均明顯好轉(zhuǎn)，逐漸回調(diào)。當(dāng)連續(xù)給予番茄紅素8 w后，與正常組大鼠相比，模型組大鼠的體重顯著降低(P<0.01)，血糖水平和腎臟指數(shù)均顯著升高(P<0.01，P<0.05)；而給藥組大鼠體重、血糖和腎臟指數(shù)均明顯回調(diào)(P<0.01，P<0.05)，表明番茄紅素對(duì)于糖尿病引起的體重降低、血糖和腎臟指數(shù)升高具有明顯改善作用。見(jiàn)表1。

表1 各組體重、血糖和腎臟指數(shù)的變化

2.2各組腎臟組織的病理學(xué)變化 經(jīng)過(guò)HE染色后可以明顯觀察到，正常組腎臟組織未出現(xiàn)異常，可以觀察到完整的腎小球結(jié)構(gòu)。而模型組腎臟組織則呈現(xiàn)出明顯的病理?yè)p傷特征，腎小球體積增大、系膜增生，可以觀察到腎小球上皮細(xì)胞呈現(xiàn)空泡并呈現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。當(dāng)給予番茄紅素后，其病理學(xué)特征均得到明顯改善，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性；表明番茄紅素能夠改善糖尿病導(dǎo)致的腎臟組織損傷。見(jiàn)圖1。

圖1 番茄紅素對(duì)糖尿病模型大鼠腎臟組織的影響(HE，×200)

2.3各組腎臟組織中氧化應(yīng)激水平比較 與正常組相比，模型組SOD、CAT和GSH-Px活性均顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)，表明模型組大鼠機(jī)體組織處于過(guò)氧化應(yīng)激狀態(tài)；當(dāng)給予番茄紅素后，腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT酶活性和MDA水平均顯著回調(diào)(P<0.05)，表明番茄紅素對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用。見(jiàn)表2。

2.4各組血清炎癥因子水平比較 與正常組相比，模型組血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高(P<0.01)，表明實(shí)驗(yàn)大鼠機(jī)體處于過(guò)炎癥狀態(tài)；當(dāng)連續(xù)給予番茄紅素8 w后，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，且番茄紅素高劑量組更加趨近正常組，表明番茄紅素對(duì)于STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血清炎癥因子水平異常升高具有明顯的改善作用。見(jiàn)表3。

表2 番茄紅素對(duì)糖尿病大鼠血清中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

2.5IKK/IKB/NF-κB信號(hào)通路 與正常組相比，模型組腎臟組織NF-κB p65、p-IKKβ/IKKβ和p-IKBα/IKBα蛋白含量顯著增加(P<0.05)，表明糖尿病大鼠機(jī)體處于炎癥狀態(tài)，IKK/IKB/NF-κB信號(hào)通路被激活；當(dāng)給予番茄紅素后，給藥組中的NF-κB p65、p-IKKβ/IKKβ和p-IKBα/IKBα蛋白含量均發(fā)生顯著回調(diào)，表明番茄紅素對(duì)于糖尿病模型大鼠腎臟組織的炎癥反應(yīng)具有顯著抑制作用；番茄紅素能夠顯著抑制IKK/IKB/NF-κB信號(hào)通路活化。見(jiàn)圖2、表4。

表3 番茄紅素對(duì)糖尿病大鼠血清中炎癥因子的影響

1～4：正常組、模型組、番茄紅素低劑量組、番茄紅素高劑量組圖2 番茄紅素對(duì)糖尿病大鼠腎臟組織IKK/IKB/NF-κB信號(hào)通路的影響

表4 番茄紅素對(duì)糖尿病大鼠腎臟組織IKK/IKB/NF-κB信號(hào)通路的影響

3 討 論

近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，人們的生活生平和飲食結(jié)構(gòu)均發(fā)生了巨大變化，糖尿病發(fā)病率也正在逐年升高，對(duì)人們的生命健康和生活質(zhì)量帶來(lái)了巨大危害〔13,14〕。目前研究表明，機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間處于高血糖狀態(tài)，會(huì)誘發(fā)機(jī)體發(fā)生病理性的生理變化，如氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)等〔15,16〕。此外，糖尿病患者通常也伴隨著脂質(zhì)代謝異常，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體氧自由基產(chǎn)生過(guò)多，誘發(fā)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。糖尿病與自身炎癥和氧化應(yīng)激損傷具有密切的關(guān)系；因此，糖尿病相關(guān)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激相關(guān)研究已經(jīng)成為當(dāng)前減緩、治療糖尿病及其并發(fā)癥的新靶點(diǎn)。

番茄紅素是一種廣泛存在于茄科植物中的類(lèi)胡蘿卜素，大量研究表明其具有抗氧化等生物活性。本研究也已證實(shí)，番茄紅素能夠顯著改善糖尿病大鼠體重異常降低和血糖水平、腎臟指數(shù)的異常升高；并能夠顯著抑制糖尿病大鼠機(jī)體氧化應(yīng)激水平。炎癥反應(yīng)是機(jī)體免疫系統(tǒng)的一種防御機(jī)制，但是長(zhǎng)期的慢性炎癥狀態(tài)則會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生病理性損傷；糖尿病是一種慢性的低度炎癥，血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子水平是監(jiān)控和評(píng)價(jià)機(jī)體炎癥狀態(tài)的重要指標(biāo)〔17,18〕；本研究發(fā)現(xiàn)番茄紅素能夠顯著抑制TNF-α、IL-1β和IL-6升高。此外，氧化應(yīng)激還可激活NF-κB等多個(gè)參與炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路，并且IL-1β水平過(guò)高，也可激活NF-κB等信號(hào)通路；進(jìn)而導(dǎo)致大量的細(xì)胞質(zhì)蛋白復(fù)合物活化，產(chǎn)生IκB激酶復(fù)合物，加重機(jī)體炎癥反應(yīng)〔19～23〕。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)連續(xù)給予番茄紅素8 w后，其N(xiāo)F-κB p65、p-IKKβ和p-IKBα蛋白含量顯著降低，表明番茄紅素能夠抑制IKK/IKB/NF-κB信號(hào)通路。

綜上，番茄紅素能夠顯著改善糖尿病模型大鼠的體重降低、降低血糖水平、改善機(jī)體炎癥水平和氧化應(yīng)激損傷，并能夠顯著改善腎臟組織損傷和細(xì)胞凋亡；其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制IKK/IKB/NF-κB信號(hào)通路活化進(jìn)而發(fā)揮作用的。