劉智鴻，李勝，高德海，劉世祺

（1.山東省藥物研究院，山東 濟(jì)南 250062；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 胃腸外科，山東 濟(jì)寧 272029）

遺傳性感覺和自主神經(jīng)?、粜停塾址Q先天性無痛無汗癥（congenital insensitivity to pain with anhidrosis,CIPA）］是一種非常罕見的常染色體隱性遺傳病［1］，發(fā)病率約為1/25 億。1963 年SWANSON［2］將其正式命名為CIPA。DYCK［3］于1983 年將伴有痛覺缺乏的各種疾病命名為遺傳性感覺和自主神經(jīng)病（hereditary sensory and autonomic neuropathy,HSAN），并根據(jù)遺傳方式和受累神經(jīng)細(xì)胞或軸突的數(shù)目進(jìn)行分型（共分為5 型），CIPA被定義為遺傳性感覺和自主神經(jīng)障礙（HSAN）Ⅳ型。

CIPA 患者常見臨床表現(xiàn)全身無汗、對疼痛刺激無反應(yīng)，出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作不明原因的發(fā)熱、感染［4］，CIPA 患者還會(huì)出現(xiàn)不同程度的骨關(guān)節(jié)病變、關(guān)節(jié)腫脹［5］、關(guān)節(jié)囊松弛等病變、Charcot 關(guān)節(jié)?。?-7］及脊柱病等。CIPA 患者還存在一定程度的智力發(fā)展缺陷［1］。多數(shù)觀點(diǎn)普遍認(rèn)為，CIPA 診斷需綜合多項(xiàng)資料進(jìn)行分析：①明確無痛覺、無汗病史及癥狀；②痛覺、溫度覺試驗(yàn)及碘淀粉法發(fā)汗定性試驗(yàn)是該病癥的診斷依據(jù)；③皮膚活檢病理有助于確診，皮膚組織結(jié)構(gòu)及汗腺形態(tài)正?；蛭s，周圍神經(jīng)無髓鞘及細(xì)小有髓鞘纖維丟失等［1］；④檢測到NTRK1 基因突變則高度支持CIPA 診斷。符合以上條件，結(jié)合患者的具體表現(xiàn)，可以確診為CIPA。在國外，CIPA 患者中已有神經(jīng)營養(yǎng)因子酪氨酸激酶受體1 型（NTRK1）為其主要致病基因報(bào)道［8-13］。INDO 等［14］于1996 年已將NTRK1 基因突變確定為CIPA 的致病原因。

本研究收集的一個(gè)CIPA 家系的基礎(chǔ)上，采集患者皮膚及皮下組織，進(jìn)行HE 染色及免疫組織化學(xué)SP 法，觀察皮膚是否神經(jīng)末梢缺如，檢測S-100 蛋白表達(dá)，明確該CIPA 患者診斷，進(jìn)一步采集該CIPA 家系成員外周血，分離白細(xì)胞、提取DNA；通過外顯子測序方法，檢測該家系NTRK1基因和FAM134B 基因的突變情況，分析其結(jié)果與表型的對應(yīng)關(guān)系，判斷其是否為該CIPA 家系的致病基因。以期發(fā)現(xiàn)全新的致病基因突變位點(diǎn)，為CIPA 的預(yù)防與診斷提供借鑒。

1 資料與方法

1.1 研究對象

患者男性，17 歲，因反復(fù)骨折3 年入院，自出生后全身皮膚無汗，經(jīng)常出現(xiàn)持續(xù)高熱，體溫增高與外界溫度有關(guān)，應(yīng)用抗菌藥物及藥物降溫治療無效，物理降溫有效。自幼感覺障礙、痛覺消失，對各種疼痛刺激均無反應(yīng)、有自殘傾向，多次骨折并發(fā)骨髓炎，智力發(fā)育遲緩。

1.2 檢查方法

1.2.1 查體 體型消瘦，全身皮膚干燥，體表無汗毛，可見多發(fā)外傷瘢痕，部分口唇及舌部尖端殘缺，背部肩胛區(qū)皮膚有潮熱感，無腋毛、陰毛。雙手掌側(cè)皮膚增厚、結(jié)繭，掌指關(guān)節(jié)處可見皮膚皸裂。十指末端指節(jié)缺如、無指甲。下肢不等長，左下肢縮短約3 cm，膝關(guān)節(jié)囊松弛，右大腿外側(cè)手術(shù)切口部分未愈合，部分深筋膜及肌肉組織壞死、深達(dá)骨質(zhì)，可見黃白色膿液，左足踇指末節(jié)缺如，左膝抽屜實(shí)驗(yàn)：90°及45°均（+）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)室檢查 肝功能：谷丙轉(zhuǎn)氨酶23 u/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶15 u/L，堿性磷酸酶明顯升高：353 u/L，血鈣降低2.08 mmol/L，膽堿酯酶降低4 737 u/L，血鐵降低：4.4 mmol/L，尿常規(guī)未見異常，尿酸明顯升高990 μmol/L。

1.2.3 溫度覺實(shí)驗(yàn) 觀察患者不能辨別冷熱，存在溫度覺障礙。

1.2.4 痛覺檢查 觀察患者全身絕大部分皮膚對疼痛刺激無反應(yīng)，耳垂、陰囊部分區(qū)域痛覺減退。

1.2.5 X 射線檢查 右股骨中下段完全骨折移位，骨皮質(zhì)變薄，骨質(zhì)疏松（見圖1A、B）。切開復(fù)位內(nèi)固定2 周后，骨折端尚未愈合（見圖1C）。2 月前左外上髁骨折內(nèi)固定術(shù)后愈合不良（見圖1D）。

1.2.6 CIPA 患者皮膚及皮下活組織病理檢測 采集CIPA 患者皮膚及皮下組織，進(jìn)行HE 染色及免疫組織化學(xué)檢測，觀察皮膚是否神經(jīng)末梢缺如，檢測S-100 蛋白表達(dá)。

1.3 基因測序

NTRK1 及FAM134B 基因外顯子測序：采集患者、其父母及胞弟外周靜脈血，提取基因組DNA（使用QIAamp DNA Blood Mini 試劑盒，德國）［15］。使用Primer 3 設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增NTRK1 的1～17 外顯子及其與內(nèi)含子交界區(qū)。PCR 反應(yīng)體系共30 μL：Taq mix15 μL，正反向引物各1 μL，基因組DNA 2 μL 和ddH2O 11 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，退火30 s；72℃延伸20～60 s，循環(huán)35 次；總延伸72℃×10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后使用ABI3700 熒光自動(dòng)測序儀（美國賽默飛世爾）進(jìn)行測序［15］，測序結(jié)果與參考序列NM002529.3 比對，以確定NTRK1 突變位點(diǎn)及類型。并進(jìn)一步與NCBI SNP、人類基因突變數(shù)據(jù)庫（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）和遺傳性周圍神經(jīng)病變突變數(shù)據(jù)庫（http：//www.molgen.ua.ac.be/CMTMutations/Mutations/Mutations.cfm）進(jìn)行比對，排除變異位點(diǎn)為基因多態(tài)性位點(diǎn)，并確定其是否為新的突變位點(diǎn)。

圖1 CIPA 患者的X 線表現(xiàn)

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)檢查結(jié)果

患者病史采集符合典型CIPA 臨床表現(xiàn)：該CIPA 患者出生后出現(xiàn)反復(fù)持續(xù)高熱，體溫隨外界溫度增高，全身皮膚無汗。自幼疼痛刺激感覺障礙，痛覺消失，有自殘傾向，頻繁受傷，多次骨折并發(fā)骨髓炎，恢復(fù)慢。智力發(fā)育不正常，伴有輕度的智力障礙。

CIPA 患者皮膚及皮下組織病理檢查：鏡下觀察表皮未見毛囊，可見汗腺萎縮（見圖2、3）。

2.2 基因測序結(jié)果

CIPA 家系成員（見圖4）基因測序編號父親（1 號）、母親（2 號）、患者（3 號）及患者弟弟（4 號）。

圖2 CIPA 患者皮膚的顯微鏡檢查

圖3 CIPA 患者皮膚免疫組織化學(xué)檢查

圖4 該CIPA 患者的遺傳家族圖譜

2.3 NTRK1 測序結(jié)果

首先對CITP 家系1 號、2 號和4 號個(gè)體NTRK 基因1 進(jìn)行測序，然后與NTRK1 基因參考序列NM_001012331 進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于NTRK1 基因的第一個(gè)外顯子完全位于高GC 區(qū)（%GC=70%），以至于用專門擴(kuò)增高GC 含量的DNA 聚合酶也不能擴(kuò)增該外顯子。對NTRK1 其他外顯子的分析結(jié)果如下：NTRK1 的外顯子3-12、14 和16 均正常。其中在外顯子13 有一個(gè)常見SNP,rs6334,C/T,1 號患者為C/C 純合，2 號患者為T/T 純合，4 號患者為C/T 雜合。外顯子2 序列（見圖5）在4 個(gè)樣品中完全正常，然而在內(nèi)含子2 的GT 后面堿基2 號樣品中為G，在1 號、3 號和4 號樣品中為一個(gè)Indel 突變。

外顯子15（見圖6）中679 位氨基酸纈氨酸GTG（纈氨酸,V）→ATG（蛋氨酸,M）。1 號樣本為G TG；2 號樣本為G/A TG；3 號樣本為G/A TG；4 號樣本為G TG。該突變?yōu)樾峦蛔?，為非同義突變。

圖5 CIPA 家系成員NTRK1 基因中內(nèi)含子2 的測序結(jié)果

圖6 CIPA 家系成員NTRK1 基因中外顯子15 的測序結(jié)果

其次對CITP 家系的1 號、2 號和4 號個(gè)體FAM134B 基因進(jìn)行測序，然后與FAM134B 基因的參考序列NM_001034850 進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于該基因的第一個(gè)外顯子也位于高GC 含量區(qū)域，故該外顯子亦未擴(kuò)增成功；同時(shí)因?yàn)樵谠摶騼?nèi)部有較多相對簡單序列的重復(fù)，故測序成功率較低，雖然進(jìn)行了多次擴(kuò)增和測序，目前還有一些外顯子未擴(kuò)增成功或測序效果較差?？煽紤]進(jìn)行克隆測序，但會(huì)增加實(shí)驗(yàn)成本。

3 討論

CIPA 是一種罕見的常染色體隱性遺傳?。?-2］。在國外，CIPA 患者中已有NTRK1 為其主要致病基因報(bào) 道［10-13］。INDO 等［14］于1996 年已將NTRK1 基因突變確定為CIPA 的致病原因。NTRK1 蛋白胞外結(jié)構(gòu)域是神經(jīng)生長因子（nerve growth factor,NGF）的結(jié)合位點(diǎn)，可誘導(dǎo)神經(jīng)軸突生長和促進(jìn)胚胎感覺和交感神經(jīng)元存活。NGF 作用通路中的缺陷會(huì)影響其他神經(jīng)元存活，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。其中NTRK1 基因的突變，可影響神經(jīng)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)信號的正常傳導(dǎo)。NTRKl 基因突變阻斷NGF 的作用通路，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。CIPA 患者因?yàn)槿鄙賹GF 信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，造成依賴NGF 的神經(jīng)元在發(fā)育中凋亡，致使背根神經(jīng)節(jié)和皮膚中無細(xì)小的有髓鞘神經(jīng)纖維與無髓鞘神經(jīng)纖維，皮膚中的汗腺缺乏自主交感神經(jīng)元的支配，最終造成淺表性痛覺的喪失和無汗現(xiàn)象［7］。該CIPA 患者皮膚及皮下組織病理活檢證實(shí)汗腺萎縮，皮膚周遭神經(jīng)無髓鞘，同時(shí)存在小有髓鞘纖維缺失，可以解釋CIPA 患者痛覺減退和無汗癥狀。

NGF 除作用神經(jīng)系統(tǒng)外［8］，可參與部分過敏性、免疫缺陷性和自身免疫性疾病等的發(fā)?。?］。CIPA 患者由于NTRK1 分子存在缺陷，NGF 信號無法得正常傳遞，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的趨化活性變?nèi)酰?2］和B 淋巴母細(xì)胞系功能失常［13］，機(jī)體抵抗力差，容易出現(xiàn)感染。

隨著外顯子技術(shù)的發(fā)展，對NTRK1 基因的研究更加深入、更加系統(tǒng)［16］，尤其是對其基因內(nèi)多態(tài)位點(diǎn)的研究［3］。近年來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，CIPA 存在多種NTRK1 基因突變［3，14，17-18］。但突變方式迄今尚未完全闡明，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，32 個(gè)CIPA 患者及家庭成員的基因分析確定了25 種突變［14］。其中6 個(gè)為移碼突變，4 個(gè)為無義突變，11 個(gè)為錯(cuò)義突變，4 個(gè)為剪接突變［3］。此后其他突變也被世界各地學(xué)者陸續(xù)報(bào)道［18-22］。截至目前人類基因突變數(shù)據(jù)庫（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）已確定的CIPA 患者NTRK1 基因突變總數(shù)共79個(gè)，分布于NTRK1 整個(gè)區(qū)域，多數(shù)突變位于12～17 外顯子區(qū)，包括43 個(gè)錯(cuò)義突變或無義突變、11個(gè)剪接異常突變、12 個(gè)微小缺失突變和10 個(gè)插入突變，以及僅有1 個(gè)大片段缺失突變，其位于gDNA 水平上的985bp,g.7335164_7336545 突變［23］表現(xiàn)為CIPA。其中2/3 的NTRK1 基因突變集中在日本。

該CIPA 家系成員NRK1 基因外顯子測序中，外顯子2 序列在4 個(gè)樣品中完全正常，然而在內(nèi)含子2 的GT 后面堿基在2 號樣品中為G，在1號、3 號和4 號樣品中為一個(gè)Indel 突變，由于該突變在剪接位點(diǎn)內(nèi)，其產(chǎn)生的后果極為嚴(yán)重，會(huì)影響內(nèi)含子2 或外顯子2 的剪接。外顯子15 中，發(fā)現(xiàn)679 位氨基酸纈氨酸GTG（纈氨酸，V）突變?yōu)锳TG（蛋氨酸，M），在1 號、4 號樣本為G TG；2 號樣本為G/A TG；3 號樣本為G/A TG。該突變?yōu)樾峦蛔?，為非同義突變，分析該突變只有母親和患者存在。結(jié)合內(nèi)含子2 中只有母親不存在Indel 突變，推測內(nèi)含子2 中Indel 突變和外顯子15 中679 位氨基酸纈氨酸GTG（纈氨酸，V）→ATG（蛋氨酸，M）共同作用下，可能會(huì)導(dǎo)致該疾病的發(fā)病，但因該疾病為罕見病例，樣本量有限，進(jìn)一步驗(yàn)證困難。

有研究發(fā)現(xiàn)，HSAN Ⅱ型（先天性感覺性神經(jīng)?。┲虏≡?yàn)? 號染色體上的FAM134B 基因發(fā)生了變異［15］。FAM134B 基因常見于背根節(jié)神經(jīng)元中，后者是負(fù)責(zé)將感覺信息傳遞給中樞神經(jīng)系統(tǒng)的初級感覺神經(jīng)元。FAM134B 基因變異也會(huì)導(dǎo)致其無法表達(dá)，使患者痛感喪失或減弱。由于CIPA致病基因迄今未完全闡明，HSAN Ⅱ型及HSAN Ⅳ型（CIPA）均為感覺障礙性疾病，均表現(xiàn)痛覺減退或消失，不能完全排除FAM134B 為CIPA 致病基因。相關(guān)文獻(xiàn)未查見CIPA 患者行FAM134B 基因檢測報(bào)道，該CIPA 家系成員FAM134B 基因外顯子測序未發(fā)現(xiàn)有意義突變，部分外顯子測序不成功，需進(jìn)行克隆測序以進(jìn)一步明確。

綜上所述，通過病史采集、體格檢查、痛溫度覺實(shí)驗(yàn)及皮膚病理活檢，可以臨床確診該患者為先天性無痛無汗癥。通過外顯子測序方法，發(fā)現(xiàn)NTRK1 基因內(nèi)含子2 中Indel 突變和外顯子15中679 位氨基酸纈氨酸GTG（纈氨酸，V）→ATG（蛋氨酸，M）突變，推測此兩種突變共同作用下，可能會(huì)導(dǎo)致該疾病的發(fā)病，但進(jìn)一步驗(yàn)證困難。FAM134B 基因未發(fā)現(xiàn)有意義突變，不能驗(yàn)證為致病基因，可能存在其他致病基因，需要進(jìn)一步研究。