周倩 饒鳳琴 霍花 齊曉嵐 廖健 洪偉

1貴州醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院∕附屬口腔醫(yī)院（貴陽550001）；2貴州醫(yī)科大學(xué)地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（貴陽550004）

在每年新增的口腔頜面部腫瘤病例中，有近85%為口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）。作為口腔頜面部中最常見的惡性腫瘤，根據(jù)2018年的一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球范圍內(nèi)口腔惡性腫瘤新增35.5 萬例，死亡人數(shù)17.7 萬例［1］。因此，深入研究OSCC 的治療方法迫在眉睫。

人體微生物群落數(shù)量龐大，能通過其自身的代謝活動(dòng)以及對(duì)宿主的免疫調(diào)節(jié)從而參與人體的生理功能［2］。多項(xiàng)研究表明，細(xì)菌在癌癥治療中有著巨大潛力，可通過提高機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答，從而抑制腫瘤的進(jìn)程［3-5］。有研究表明，分別向原位腦腫瘤的大鼠、自發(fā)性實(shí)體瘤的犬以及晚期平滑肌肉瘤的患者注射諾維氏梭狀芽孢桿菌可以有效殺傷癌細(xì)胞，并且誘發(fā)炎癥反應(yīng)進(jìn)一步遏制腫瘤的生長［6］。在接受諾維氏梭狀芽孢桿菌治療的患者中，有42%的患者腫瘤尺寸明顯縮小［7］。NAKATSUJI 等［8］研究表明，分離自健康人類皮膚的表皮葡萄球菌可產(chǎn)生6-HAP 以抑制黑色素瘤的生長。RUBIO 等［9］研究證實(shí)，芽孢桿菌的毒素能作用于CDH11 細(xì)胞膜受體，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的活性。此外，芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物還能對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞及急性淋巴白血病T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性［10］。當(dāng)芽孢桿菌被巨噬細(xì)胞吞噬后，芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶InhA1 能剪切NprA 幫助芽孢桿菌從宿主巨噬細(xì)胞中逃逸，避免了免疫細(xì)胞攻擊［11］。微生物的感染常能引起炎癥的產(chǎn)生［12］。有研究表明，芽孢桿菌感染小鼠后，NF-κB 上游的TLR 受體能夠識(shí)別感染并啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，顯著上調(diào)CXCL1、CXCL2 及CXCL10 等炎癥相關(guān)基因的表達(dá)［13］。芽孢桿菌抑制OSCC 發(fā)展的作用機(jī)制目前尚未明確。因此，本次實(shí)驗(yàn)采用最常見的蠟樣芽孢桿菌，旨在研究其對(duì)OSCC 增殖、遷移及侵襲能力的改變，并探索可能的機(jī)制，以期更深入的了解OSCC 與微生物間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、細(xì)胞株及菌株人OSCC 細(xì)胞SCC-25（四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院提供），蠟樣芽孢桿菌ZQ-2（貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供），胎牛血清（Gibco，USA），DMEM 培養(yǎng)基（Sigma，USA），青鏈霉素混合液（Gibco，USA），兔抗人P65、pP65、IκBα、pIκBα、IKKγ、GAPDH 單克隆抗體（Abcam，USA），羊抗兔二抗（Absin，CHN），BHI培養(yǎng)基（Solarbio，CHN），CCK-8 試劑盒（Dojindo，CHN），ECL 顯影液（Absin，CHN），BAY 11-7082 抑制劑（Beyotime，CHN）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)SCC-25 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100 U∕mL 青霉素和100 μg∕mL 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃，5% CO2孵育。細(xì)胞融合85% ～90%時(shí)，0.25%胰酶消化，傳代備用。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算SCC-25 細(xì)胞培養(yǎng)于6 孔板上，密度達(dá)到85%～90%時(shí)的細(xì)胞數(shù)量。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)蠟樣芽孢桿菌ZQ-23 接種于5 mL BHI 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。稀釋涂布平板法計(jì)算細(xì)菌數(shù)量。菌液離心后棄上清，細(xì)菌重懸于無血清無雙抗DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)菌濃度為1×109CFU∕mL 備用。

1.4 構(gòu)建細(xì)菌感染細(xì)胞模型細(xì)胞接種于6 孔板培養(yǎng)24 h。根據(jù)感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI），即蠟樣芽胞桿菌數(shù)與SCC-25 細(xì)胞數(shù)的比值，將MOI 分別為1、50、100 及200 時(shí)相應(yīng)細(xì)菌數(shù)的蠟樣芽孢桿菌，加入6 孔板與細(xì)胞共培養(yǎng)3 h后，更換含雙抗及血清的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)0、3、6、9、12、24 h，收集細(xì)胞。以上培養(yǎng)條件均為37 ℃，5%CO2。實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組（SCC-25細(xì)胞）、對(duì)照+BAY 11-7082 組（SCC-25 細(xì)胞+NF-κB 抑制劑）、共培養(yǎng)組（蠟樣芽孢桿菌+SCC-25 細(xì)胞共培養(yǎng)）、共培養(yǎng)+BAY 11-7082組（蠟樣芽孢桿菌+SCC-25 細(xì)胞共培養(yǎng)+NF-κB 抑制劑）。

1.5 CCK-8 檢測(cè)將細(xì)胞2.2×103個(gè)接種于96 孔板，每孔加培養(yǎng)液100 μL。待細(xì)胞貼壁，加入蠟樣芽孢桿菌共培養(yǎng)。每孔加入10 μL CCK-8檢測(cè)液，孵育2 h，酶標(biāo)儀在波長450 mm 處檢測(cè)吸光值（OD450）。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞接種于6孔板，無血清DMEM培養(yǎng)24 h。每孔使用絲裂霉素0.02 mg∕mL 處理2 h后，加入蠟樣芽胞桿菌培養(yǎng)3 h，用200 μL 槍頭垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕，加入含雙抗的無血清培養(yǎng)基，于0、24、48、72 h 拍照，計(jì)算各時(shí)間段細(xì)胞遷移率。遷移率=（TX面積-T0面積）∕T0面積。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)將基質(zhì)膠與DMEM培養(yǎng)基按1∶8 比例混合加入Transwell 上室，37 ℃凝固2 h。收集感染后的細(xì)胞清洗消化重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)∕mL，取100 μL 細(xì)胞懸液加入Transwell 上室，下室加入500 μL 培養(yǎng)基放入37 ℃培育24 h，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色后在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野計(jì)算細(xì)胞數(shù)。

1.8 Western blot將收集到的細(xì)胞加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰上裂解40 min，4 ℃12 000 r∕min 離心15 min，取上清，獲得總 蛋 白。BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。從收集的上清液中提取蛋白質(zhì)經(jīng)過高溫煮沸變性，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗（GAPDH、P65、pP65、pIκBα、IκBα、IKKγ）4 ℃孵育過夜，羊抗兔二抗室溫孵育1 h，ECL 顯影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用GraphPad Prism 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量數(shù)據(jù)采用表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。兩組間的比較使用t檢驗(yàn)，多組間的比較使用單因素方差分析檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蠟樣芽孢桿菌抑制細(xì)胞增殖選擇MOI 為1、50、100、200 及300 感染細(xì)胞后培養(yǎng)24 h，與對(duì)照組相比較，MOI 為300 時(shí)細(xì)胞活性受到抑制（P＜0.001）。檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)蠟樣芽孢桿菌對(duì)SCC-25細(xì)胞增殖變化，結(jié)果顯示感染后培養(yǎng)48 h 后，共培養(yǎng)組細(xì)胞活性明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

2.2 蠟樣芽孢桿菌抑制細(xì)胞遷移及侵襲采用劃痕實(shí)驗(yàn)于感染后0、24、48、72 h 觀察SCC-25 細(xì)胞遷移狀態(tài)。隨著時(shí)間變化，受感染的SCC-25 細(xì)胞遷移率明顯低于同一時(shí)間段對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，共培養(yǎng)組細(xì)胞侵襲數(shù)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖1 蠟樣芽孢桿菌對(duì)SCC-25 細(xì)胞活性及增殖能力的影響Fig.1 Effect of Bacillus on the activityand proliferation of SCC-25

圖2 蠟樣芽孢桿菌對(duì)SCC-25 細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響Fig.2 The effect of Bacillus on migration andinvasion of SCC-25

2.3 蠟樣芽孢桿菌調(diào)控NF-κB 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Western blot 結(jié)果表明，蠟樣芽孢桿菌激活SCC-25 細(xì)胞NF-κB 信號(hào)通路。當(dāng)感染后培養(yǎng)時(shí)間為12 h 時(shí)，隨MOI 升高，P65 及IκBα磷酸化水平上升，IKKγ被活化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)MOI = 50，pP65 表達(dá)量在感染后培養(yǎng)0 h 達(dá)到最大，pIκBα及IKKγ9h 則在9 h 時(shí)最高。此外，蠟樣芽孢桿菌感染的SCC-25 細(xì)胞經(jīng)NF-κB 抑制劑BAY 11-7082 處理后，pP65、pIκBα、IKKγ表達(dá)受到抑制，NF-κB 通路激活受阻（圖3）。

圖3 蠟樣芽胞桿菌對(duì)SCC-25 細(xì)胞NF-κB 信號(hào)通路的影響Fig.3 Effect of Bacillus on NF-κB signaling pathway of SCC-25

2.4 抑制NF-κB 信號(hào)通路后蠟樣芽孢桿菌促SCC-25 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力增強(qiáng)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組細(xì)胞活性明顯低于共培養(yǎng)組+BAY 11-7082，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell 結(jié)果表明，經(jīng)NF-κB抑制劑BAY 11-7082 處理后，受感染的SCC-25 細(xì)胞遷移率及侵襲數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

3 討論

目前，在癌癥治療中，利用微生物自身特性及其代謝產(chǎn)物開發(fā)新的抗癌手段已成為趨勢(shì)。ANTIC等［14］認(rèn)為來自創(chuàng)傷弧菌的MARTX 蛋白可以通過剪切Ras 蛋白使其失活，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長。大腸桿菌-CP1 能夠直接作用于前列腺癌病變組織，發(fā)揮抑癌特性［15］。芽孢桿菌的毒素制劑還可高效靶向殺滅膀胱癌細(xì)胞［16］。本研究選擇SCC-25細(xì)胞作為研究對(duì)象，首次觀察了蠟樣芽孢桿菌對(duì)SCC-25 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，探討蠟樣芽孢桿菌對(duì)炎癥相關(guān)NF-κB 通路表達(dá)水平的改變情況，以及蠟樣芽孢桿菌調(diào)控NF-κB 通路以抑制SCC-25 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，OSCC 細(xì)胞SCC-25 感染蠟樣芽孢桿菌后，炎癥相關(guān)NF-κB 信號(hào)通路中P65 及IκBα發(fā)生磷酸化，意味著NF-κB 信號(hào)通路活化；加入抑制劑BAY 11-7082 后，以上蛋白磷酸化受到抑制。此外，還檢測(cè)到了蠟樣芽孢桿菌對(duì)SCC-25 細(xì)胞IKKγ表達(dá)的影響。有研究發(fā)現(xiàn)IKKγ能調(diào)節(jié)IKK復(fù)合體的形成以及信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)NF-κB 的活化，從而影響喉鱗癌細(xì)胞功能［17］。有學(xué)者認(rèn)為，細(xì)胞對(duì)蠟樣芽孢桿菌的炎癥反應(yīng)，可能是由于來自蠟樣芽孢桿菌分泌的溶血性腸毒素和非溶血性腸毒素結(jié)合細(xì)胞膜受體，在細(xì)胞表面形成裂孔，引起K+外流，激活NF-κB下游的NLRP3炎癥小體［18-19］。筆者推測(cè)蠟樣芽孢桿菌對(duì)SCC25 細(xì)胞NF-κB 通路的調(diào)控可能也與這兩種腸毒素的分泌有關(guān)。

NF-κB 是炎癥中至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤的增殖、遷移及侵襲等進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用［20］。本研究證明，蠟樣芽孢桿菌抑制OSCC 細(xì)胞SCC-25增殖、遷移及侵襲。加入抑制劑發(fā)現(xiàn)，增殖、遷移及侵襲能力明顯增高。這說明，蠟樣芽孢桿菌抑制SCC-25 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的機(jī)制是通過調(diào)控NF-κB 信號(hào)達(dá)到的。

綜上所述，本研究首次報(bào)道了蠟樣芽孢桿菌通過調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路以抑制OSCC 細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，意味著應(yīng)用蠟樣芽孢桿菌可能發(fā)展成為一種新的OSCC 治療手段，為腫瘤治療提供新的思路。然而，本研究仍缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以探究蠟樣芽孢桿菌抑制OSCC 的功能，后續(xù)本課題組也將進(jìn)行更深層次的探索。