杜 康 張 尉 顧麗莉,* 張 花 黃智華 姚 雯

(1 昆明理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南 昆明 650500；2 云南省煙草公司玉溪市公司，云南 玉溪 653100)

煙葉中含有300多種化合物，其中主要的生物活性物質(zhì)，如煙堿、新植二烯、茄尼醇、綠原酸、蘆丁、果膠和煙草蛋白等，在化工、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[1-2]。新植二烯是具有20個(gè)碳原子的聚類異戊二烯類香味物質(zhì)，是煙葉中重要的致香物質(zhì)。研究表明，新植二烯主要由天然綠色植物中的葉綠素經(jīng)降解、轉(zhuǎn)化衍生而來(lái)，在煙葉中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.06%～0.10%[3]。新植二烯作為捕集煙氣氣溶膠內(nèi)香氣物質(zhì)的載體，具有攜帶煙葉中揮發(fā)性香氣物質(zhì)和致香成分進(jìn)入煙氣的能力，也是煙葉的重要增香劑[4]，在低溫不燃新型卷煙中不可替代。煙堿(nicotine)，又稱尼古丁，在煙葉中以(S)-3-(1-甲基-2-吡咯烷基)-吡啶存在，是香煙本身的基本成分之一，具有強(qiáng)烈的生理活性，其最新的應(yīng)用現(xiàn)狀是作為一種新型口含煙的主要添加成分[5]。據(jù)報(bào)道，煙堿可改善患者的健康狀況，如癡呆癥、精神分裂癥、多巴胺能神經(jīng)元和軸突、皮膚溫和認(rèn)知功能障礙、左旋多巴誘發(fā)運(yùn)動(dòng)障礙等。煙堿還具有抗菌作用和殺蟲(chóng)活性，可作為天然殺蟲(chóng)劑[6]，而且具有易降解、對(duì)人體無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)煙草中的化學(xué)成分較復(fù)雜，其成分含量受諸多因素的影響，如煙葉品種、種植方式、氣候環(huán)境和煙葉部位等[7-8]。

常見(jiàn)天然植物成分的提取方法有超聲輔助提取法、溶劑提取法和超臨界流體萃取法等[9-12]。鄧小華[13]采用超臨界萃取技術(shù)得到萃取產(chǎn)物中新植二烯含量為22.61%；尚憲超等[14]采用深共熔溶劑提取煙葉中煙堿，最佳工藝條件下煙堿得率為22.72 mg·g-1；Hu等[15]采用柱層析萃取法同時(shí)從廢煙草中提取和分離純化尼古丁和茄尼醇；楊君等[16]采用超聲輔助溶劑法提取煙草精油，檢測(cè)結(jié)果表明煙油中煙堿含量為25.41%、新植二烯含量為38.55%；康明娥等[17]以四氫呋喃為原料，以對(duì)甲苯磺酸為催化劑，合成了質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44.17%的新植二烯，但此方法合成路線復(fù)雜、易出現(xiàn)異構(gòu)體。綜上，已有提取工藝的目標(biāo)成分含量低、產(chǎn)品得率低，且以煙堿和新植二烯為目標(biāo)的提取工藝極少。因此，本試驗(yàn)以云南典型初烤煙葉為原料，采用氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)分析萃取物組成，比較了4種工藝下煙葉精油萃取產(chǎn)物中煙堿和新植二烯的含量，以期確定安全、高效和操作簡(jiǎn)單的煙葉煙油萃取工藝，為下一步煙堿和新植二烯的分離純化提供最佳物料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

初烤煙(C3F k326)取自云南華寧地區(qū)。正己烷、乙醇(分析純)，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；二氯甲烷(分析純)，四川西隴化工有限公司；三氯甲烷(分析純)，重慶川東化工有限公司；無(wú)水硫酸鈉(分析純)，重慶北碚化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SFE-500超臨界流體萃取設(shè)備，美國(guó)Thar科技公司；DC-0515低溫恒溫槽，上海衡平儀器儀表廠；BSA224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用設(shè)備，安捷倫科技(中國(guó))有限公司；RHP-600高速多功能粉碎機(jī)，浙江榮浩工貿(mào)有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

將初烤煙葉粉碎，過(guò)60目篩，作為待分離煙葉原料，備用。

1.3.1 溶劑萃取 稱取80 g原料，分為4組，每組20 g，分別放入250 mL錐形瓶中，選擇無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷和正己烷不同極性的溶劑進(jìn)行萃取。每種溶劑用量100 mL，分別加入裝有原料的錐形瓶中，振蕩搖勻后密封，靜置24 h后，過(guò)濾，旋蒸至溶劑完全蒸發(fā)，得到黃色油狀液體，計(jì)算煙油提取得率，并進(jìn)行成分分析。

按照公式計(jì)算煙油提取得率(E)：

E=m/M×100%

式中，m為煙油質(zhì)量，g；M為煙葉原料質(zhì)量，g。

同時(shí)考察了不同濃度乙醇作為萃取劑時(shí)對(duì)煙葉精油得率的影響。稱取80 g原料，均分為4組，每組為20 g，分別放入250 mL錐形瓶中，選擇25%、50%、75%和100% 4種不同濃度的乙醇溶液作為萃取劑進(jìn)行溶劑萃取，每組溶劑用量100 mL，分別加入裝有原料的錐形瓶中，振蕩搖勻后密封，靜置24 h后過(guò)濾，旋蒸，至溶劑完全蒸發(fā)，得到黃色油狀液體，計(jì)算煙油提取得率。

1.3.2 超聲輔助萃取 稱取20 g原料，置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL一定濃度的乙醇。之后進(jìn)行超聲提取，超聲功率240 W，溫度40℃，超聲50 min，然后將提取液密封，靜置10 min后過(guò)濾，旋蒸除去溶劑，得到黃色油狀液體，計(jì)算煙油提取得率，并進(jìn)行成分分析。

1.3.3 索式回流萃取 稱取10 g原料裝入索氏提取管中，并安裝于250 mL圓底燒瓶上，采用200 mL一定濃度乙醇作為萃取劑，熱回流溫度控制在90℃，回流2次，自然降溫后，收集回流液，旋蒸除去溶劑，得到淺黃色油狀液體，計(jì)算煙油提取得率，并進(jìn)行成分分析。

1.3.4 超臨界CO2萃取 稱取60 g原料，置于500 mL超臨界CO2萃取罐中，設(shè)定操作參數(shù)：萃取罐壓力30 MPa，萃取溫度50℃，CO2流量20 g·min-1，夾帶劑無(wú)水乙醇流量1 g·min-1，萃取時(shí)間2 h；分離罐壓力5 MPa，分離溫度40℃。試驗(yàn)結(jié)束后，從分離罐中接出淡黃色且具有煙草香味的油狀液體，計(jì)算煙油提取得率，并進(jìn)行成分分析。

1.4 GC-MS分析

1.4.1 樣品前處理 用移液槍量取各萃取物50 μL，并用3 mL二氯甲烷溶解，無(wú)水硫酸鈉除去水分，用0.22 μm微膜過(guò)濾，配成一定濃度的樣品，進(jìn)行GC-MS分析。

1.4.2 GC-MS分析條件 色譜柱：HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：250℃；程序升溫：柱溫 80℃，保持1 min，以5℃·min-1升至200℃，保持3 min；最后以8℃·min-1升至280℃，保持10 min；載氣：He；流量1.0 mL·min-1；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比50∶1，進(jìn)樣體積：0.2 μL。

離子源：EI源，離子源溫度：230℃，四極桿溫度：150℃；電離能：70 eV，全離子掃描檢測(cè)質(zhì)量數(shù)范圍50～550 amu, 溶劑延遲：3 min。

1.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

采用Origin 2018軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對(duì)萃取煙油得率的影響

由圖1可知，當(dāng)以無(wú)水乙醇作為萃取劑時(shí)，3種萃取方法的煙油得率接近，且均較低，然而索式回流萃取法的煙油得率略高于溶劑萃取和超聲輔助萃取法；含水乙醇作為萃取劑時(shí)，超聲輔助萃取和溶劑萃取法的煙油得率遠(yuǎn)高于索式回流萃取法，而超聲輔助萃取法的煙油得率又略高于溶劑萃取法；當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)，3種萃取方法的煙油得率均比其他乙醇溶液組高。這可能是由于水分子的極性大于乙醇分子，隨著含水量的增加，其極性變大，煙葉中極性較大的水溶性物質(zhì)會(huì)更多地被萃取出來(lái)，如油脂、類脂磷脂、蠟質(zhì)、樹(shù)脂等[18-19]，致使煙油得率提高。與醇濃度為50%相比，乙醇濃度為25%時(shí)，煙油得率略有下降，說(shuō)明極性大的溶劑不利于極性較小物質(zhì)的溶出。試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)選用二氯甲烷作為稀釋劑時(shí)，只有100%乙醇萃取下的煙油能完全溶解，50%、75%乙醇水溶液萃取出的煙油只有少量能溶解，25%乙醇水溶液萃取的煙油幾乎不溶于二氯甲烷。因此，在水存在的萃取環(huán)境下，煙油得率提高的原因在于煙葉中水溶性蠟質(zhì)類物質(zhì)被萃取出來(lái)。結(jié)合GC-MS分析結(jié)果，煙油得率的提高對(duì)煙堿和新植二烯的含量變化幾乎無(wú)影響。故采用純乙醇作為萃取溶劑，其得到的煙油將有利于后期煙堿和新植二烯的分離和檢測(cè)。

2.2 有機(jī)萃取劑的極性對(duì)煙油得率的影響

采用溶劑萃取方法，選擇4種不同極性的萃取溶劑：乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷和正己烷(極性大小順序?yàn)橐掖?乙酸乙酯>三氯甲烷>正己烷)，比較不同極性大小萃取劑對(duì)煙油得率的影響。

由圖2可知，隨著溶劑極性的降低，其煙油得率呈下降趨勢(shì)，萃取劑的極性對(duì)煙油得率確有影響。另外，當(dāng)以三氯甲烷作為萃取劑時(shí)，本試驗(yàn)煙油得率高于文獻(xiàn)[20]的煙油得率，可能是煙葉原料來(lái)自不同地區(qū)或方法不同所致。

圖2 不同極性溶劑下煙油的得率

2.3 不同萃取方法對(duì)煙油得率的影響

由圖3可知，不同萃取方法下煙油得率差異較大，4種萃取方法煙油得率由高到低依次為索式回流萃取>超聲輔助萃取>溶劑萃取>超臨界CO2萃取。雖然索式回流萃取煙油得率最高，但索式熱回流萃取存在溫度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致萃取物中熱敏性物質(zhì)分解或變性的缺點(diǎn)，因此，萃取過(guò)程中應(yīng)控制操作溫度，防止煙油中的成分分解或變性；超聲輔助萃取油煙得率高于乙醇溶劑萃取，再次表明，超聲破壁作用不僅能縮短萃取時(shí)間[21]，而且能提高煙油得率。但溶劑萃取和超聲輔助萃取都存在溶劑殘留、萃取物中雜質(zhì)較多的缺點(diǎn)，而且可能會(huì)增加目標(biāo)物質(zhì)的分離難度；超臨界CO2萃取雖然得率最低，但該方法具有溶劑與萃取物可完全分離、無(wú)溶劑殘留、操作溫度低和萃取時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[21-22]。針對(duì)煙堿和新植二烯的分離，需對(duì)上述萃取產(chǎn)物的成分進(jìn)行分析，煙油得率結(jié)合萃取物中二者的相對(duì)含量選擇最佳的提取方法。

圖3 不同萃取方法的煙油得率比較

2.4 萃取產(chǎn)物中的主要成分

2.4.1 超臨界CO2萃取產(chǎn)物成分 將超臨界CO2萃取物進(jìn)行GC-MS分析，以峰面積歸一法測(cè)得萃取物中各組分的相對(duì)含量，其總離子流圖如圖4所示。

對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到質(zhì)譜圖，經(jīng)過(guò)質(zhì)譜數(shù)據(jù)(NIST)系統(tǒng)檢索，確定煙葉萃取物中含有52種化合物，圖4中的7個(gè)峰對(duì)應(yīng)的主要成分總占比達(dá)到86.53%，其化合物及相對(duì)含量見(jiàn)表1。

2.4.2 超聲波輔助萃取產(chǎn)物成分 圖5是超聲波輔助乙醇萃取初烤煙葉產(chǎn)物的GC-MS總離子流圖，可確定萃取物中含47種化合物，6個(gè)峰對(duì)應(yīng)的6種化合物相對(duì)含量總占比為86.00%，其化合物和相對(duì)含量見(jiàn)表2。

2.4.3 索式回流萃取產(chǎn)物成分 乙醇作為萃取劑，采用索式回流萃取，其萃取產(chǎn)物的GC-MS總離子流圖如圖6所示。由檢測(cè)數(shù)據(jù)可知，共有化合物40種，只有1個(gè)主峰，其保留時(shí)間為13.643 min，對(duì)應(yīng)物質(zhì)為(S)-3-(1-甲基-2-吡咯烷基)-吡啶(煙堿)，其相對(duì)含量達(dá)75.58%。

圖4 超臨界CO2萃取初烤煙葉產(chǎn)物的成分總離子流圖

表1 超臨界CO2萃取產(chǎn)物的主要成分

表2 超聲輔助萃取物的主要成分

圖5 超聲波輔助萃取初烤煙葉產(chǎn)物中成分的總離子流圖

圖6 索式回流萃取初烤煙葉產(chǎn)物成分的總離子流圖

2.4.4 乙醇溶劑萃取物成分 以乙醇為萃取劑，采用溶劑萃取，其萃取物的GC-MS總離子流圖如圖7所示。萃取物中共檢出46種物質(zhì)，譜圖中只有1個(gè)主峰，其保留時(shí)間為20.784 min，對(duì)應(yīng)物質(zhì)為新植二烯，其相對(duì)含量為45.20%。

圖7 乙醇溶劑萃取初烤煙葉產(chǎn)物成分的總離子流圖

由表3可知，不同萃取劑和萃取方法下得到的煙油中成分相差較大。索式回流萃取的煙葉精油，不僅煙油得率高，而且煙油中煙堿含量最高，可作為最佳初提物用于煙堿的進(jìn)一步提純；乙醇溶劑萃取的煙葉精油得率高于相同萃取方法下采用其他萃取溶劑的得率，且煙油中主要成分為新植二烯，利于進(jìn)一步純化新植二烯。

2.5 煙堿和新植二烯相對(duì)含量比較

圖8 萃取物中煙堿和新植二烯相對(duì)含量比較

結(jié)合2.4中萃取產(chǎn)物化學(xué)成分分析和表3，不同萃取劑和萃取方法的煙油得率、含有的總物質(zhì)數(shù)和主要化合物的相對(duì)含量均有較大差異。低極性的溶劑萃取，如用正己烷、三氯甲烷萃取的產(chǎn)物中有100多種化合物，但主要化合物只有6～9種，其相對(duì)含量總占比分別達(dá)到66.23%和78.28%，說(shuō)明煙草中較多小極性的物質(zhì)易在低極性溶劑萃取出，但這些物質(zhì)的含量均較低，符合相似相溶原理，并且與文獻(xiàn)[24-25]結(jié)果一致。乙醇索式回流萃取煙油得率較高，萃取產(chǎn)物中主要物質(zhì)為煙堿，說(shuō)明適當(dāng)?shù)募訜嵊欣跓焿A的提取。從表3來(lái)看，超臨界CO2萃取和乙醇超聲輔助萃取所得到的萃取產(chǎn)物中化合物總數(shù)基本相同，但主要成分的相對(duì)含量存在一定差異。乙醇溶劑萃取與乙醇超聲輔助萃取結(jié)果相比，超聲輔助不僅能提高煙油得率，而且有更多的物質(zhì)被萃取出。由此可見(jiàn)，一定功率的超聲作用增強(qiáng)了煙葉植物細(xì)胞壁破裂的程度，更有利于物質(zhì)溶出，使其有效成分更多地被萃取出來(lái)[26]。由圖8可知，不同萃取方法得到萃取產(chǎn)物中煙堿和新植二烯的相對(duì)含量有所不同，乙醇索式回流萃取產(chǎn)物中煙堿相對(duì)含量最高，達(dá)到75.58%；乙醇溶劑萃取產(chǎn)物中新植二烯相對(duì)含量最高，為45.20%。

表3 不同萃取劑和萃取方法的結(jié)果匯總

3 討論

本研究以云南典型初烤煙葉為原料，探究不同萃取方法下的煙油得率，并對(duì)萃取得到的煙油進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，確定煙油中的主要成分，最后以煙堿和新植二烯相對(duì)含量為目標(biāo)，確定最優(yōu)的提取工藝。

溶劑萃取中，隨著萃取劑極性的增大，即正己烷<三氯甲烷<乙酸乙酯<乙醇，煙油中煙堿相對(duì)含量先增大后減小，三氯甲烷作為萃取劑的煙堿相對(duì)含量最高，達(dá)到31.19%，這與煙堿分子中N原子的存在形式、官能團(tuán)極性大小等密切相關(guān)，在煙堿分子結(jié)構(gòu)中，有以單鍵相連的2個(gè)含氮雜環(huán)-吡啶環(huán)和吡咯環(huán)，這2個(gè)雜環(huán)胺的官能團(tuán)均屬叔胺型[27]，極易溶于氯仿、鹵代烷烴等低極性溶劑；隨著萃取劑極性的增大，新植二烯的相對(duì)含量先減小后增大，其中乙醇作為萃取劑其相對(duì)含量最高，達(dá)到45.20%，這與新植二烯具體形成的過(guò)程有關(guān)，因?yàn)槠湓跓熑~調(diào)制陳化過(guò)程中先由葉綠素降解產(chǎn)生葉綠醇(植醇)，進(jìn)而由葉綠醇脫水而形成含有20個(gè)碳原子的聚類異戊二烯，除此以外，裂解產(chǎn)物中還有大量的醇類酯類物質(zhì)產(chǎn)生[28]，而乙醇作為一種極性較為適合、無(wú)毒無(wú)害的醇類萃取劑，有較好的相似相溶性，從而達(dá)到良好的萃取效果。

本研究在超臨界CO2流體萃取過(guò)程中使用乙醇作為夾帶劑，擴(kuò)展了萃取劑的極性范圍，即從CO2的非極性延伸到少量乙醇介入的弱極性，兼顧了非極性長(zhǎng)鏈烯烴新植二烯和弱極性含2個(gè)雜環(huán)胺官能團(tuán)的煙堿，使新植二烯和煙堿均可有效萃取出。乙醇超聲輔助萃取法得到的萃取產(chǎn)物中，煙堿(32.28%)和新植二烯(28.24%)的相對(duì)含量與文獻(xiàn)[16]基本一致(煙堿25.4%，新植二烯38.55%)。乙醇索式回流萃取法得到煙油中煙堿相對(duì)含量最高(75.58%)，經(jīng)考察，這與萃取溫度有關(guān)，升溫有利于增大溶質(zhì)的溶解度和傳質(zhì)速率，適當(dāng)加熱既保持了煙堿的穩(wěn)定性，又提高了其在乙醇中的溶解度，使得煙油中煙堿的相對(duì)含量較高。以上對(duì)初烤煙葉中煙堿和新植二烯提取工藝的研究，將有利于深入探究高純度煙堿和新植二烯產(chǎn)品的分離。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了超臨界CO2萃取、超聲輔助萃取、索式回流萃取和溶劑萃取4種方法提取云南典型初烤煙葉精油的工藝，考察了不同萃取方法下的煙油得率，并確定了針對(duì)煙堿和新植二烯的最佳初提方法。結(jié)果表明，乙醇作為萃取劑時(shí)，索式回流萃取煙葉精油得率最高，且煙油中煙堿的相對(duì)含量最高，可以作為進(jìn)一步分離純化煙堿的初級(jí)提取過(guò)程；在溶劑萃取過(guò)程中，以乙醇為萃取劑的提取效果好于其他萃取劑，其煙油得率高，且新植二烯含量最高。因此，乙醇溶劑萃取可選為分離純化新植二烯的較佳初級(jí)提取工藝。本研究為云南初烤煙中煙葉精油及煙堿和新植二烯的提取過(guò)程提供了參考依據(jù)和可行性良好的多種工藝途徑，且其乙醇索式回流萃取和乙醇溶劑萃取下的初提物可作為下一步高純度煙堿和新植二烯的較佳純化原料。