国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

專用采血管對血漿中循環(huán)游離DNA保存效果的影響*

2021-04-29 02:32段小瑜張海梅原昆鵬
檢驗醫(yī)學(xué)與臨床 2021年8期
關(guān)鍵詞:核酸酶專用血漿

徐 鵬,段小瑜△,張海梅,原昆鵬

1.威高集團(tuán)有限公司國家工程實驗室,山東威海 264210;2.山東高創(chuàng)醫(yī)療器械國家研究院有限公司,山東威海 264210;3.山東威高集團(tuán)醫(yī)用高分子制品股份有限公司,山東威海 264210

循環(huán)游離DNA(cfDNA)是指存在于人體外周血液中、游離于細(xì)胞之外的DNA,包括細(xì)胞溶解破裂后釋放到血液中的DNA及胎兒細(xì)胞和突變細(xì)胞釋放到血液中的外源DNA。血液中cfDNA被發(fā)現(xiàn)已經(jīng)超過60年了[1],然而直到1977年LEON和他的同事在癌癥患者血液中發(fā)現(xiàn)cfDNA水平升高,cfDNA在臨床醫(yī)學(xué)中的重要性才被人們所意識到[2]。近幾年由于DNA分離提取、定量檢測及測序等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,對cfDNA的研究和臨床應(yīng)用也取得突破,尤其在產(chǎn)前診斷、腫瘤疾病的篩查、治療檢測和預(yù)后評估等方面表現(xiàn)出令人振奮的應(yīng)用潛力。

孕婦血漿中的cfDNA在無創(chuàng)遺傳病產(chǎn)前診斷中發(fā)揮重要作用[3]。研究表明,胎兒和腫瘤細(xì)胞來源的cfDNA水平非常低,僅占總cfDNA水平的10%以下[4],因此cfDNA檢測的準(zhǔn)確性和可靠性是其后續(xù)臨床應(yīng)用的基本保障。在血液標(biāo)本的體外儲存和運輸過程中,不可避免地伴隨著白細(xì)胞基因組DNA的釋放及核酸酶對cfDNA的降解[5],導(dǎo)致特異的cfDNA片段大小和比例發(fā)生變化,大量母源DNA的釋放會影響胎兒DNA的檢出,尤其會增加與母源DNA序列差異不大的胎兒DNA序列的檢出[6]。臨床檢測cfDNA時,阻止基因組DNA污染的一種處理方式是靜脈采血后立即處理血樣,但這種方式會限制cfDNA作為生物標(biāo)志物的應(yīng)用范圍,尤其在缺乏血漿分離和低溫儲藏設(shè)備的地區(qū),而使用cfDNA專用采血管采集血液標(biāo)本,血液標(biāo)本經(jīng)常溫保存和長時間運輸后,仍能從血漿中提取得到高質(zhì)量的cfDNA,這種專用采血管在無創(chuàng)產(chǎn)前診斷和腫瘤防控中顯示出重要作用。不同實驗室對血漿cfDNA片段分布進(jìn)行測序研究,結(jié)果一致表明,cfDNA片段大小主要分布在166 bp[7-8],cfDNA片段大小成為利用PCR技術(shù)進(jìn)行定量檢測時首要考慮的因素[9]。本文采用人Leptin基因166 bp片段來研究不同保存時間血漿中cfDNA水平變化情況,與EDTA-K2抗凝管對比,探討cfDNA專用采血管對延長血液中cfDNA保存時間的效果。

1 資料與方法

1.1儀器和設(shè)備 EDTA-K2抗凝管(E)為威高集團(tuán)產(chǎn)品,cfDNA專用采血管K及cfDNA專用采血管A為兩個cfDNA保存管品牌。游離DNA提取試劑盒品牌為海貍生物。熒光定量PCR儀品牌為西安天隆Gentier 96 E。

1.2招募志愿者 志愿者來自威高集團(tuán)職工,年齡25~30歲,健康的男性和女性各10例,入選的志愿者均被告知并簽署知情同意書。

1.3方法

1.3.1血液采集 所有志愿者均空腹進(jìn)行血液采集,實驗分6個時間點采集每例志愿者的血液標(biāo)本到一支10 mL的EDTA-K2抗凝管和兩支10 mL cfDNA專用采血管中,采血量達(dá)到管壁標(biāo)簽標(biāo)示刻度體積,每管采血完畢后立即輕柔倒轉(zhuǎn)顛倒混勻10次,充分混勻血樣與保護(hù)劑,將所有采血管放置于室溫儲存。

1.3.2血漿分離 分別在2 h、4 d、7 d、10 d、14 d、15 d 6個時間點取出所有血液標(biāo)本,顛倒混勻后于4 ℃ 1 600×g離心10 min,轉(zhuǎn)移最上層淡黃色血漿層至已標(biāo)記的2 mL離心管中。4 ℃,1 600×g,將每個2 mL離心管再次離心10 min,用移液器小心吸取血漿層至新的1.5 mL的離心管中,以上兩步轉(zhuǎn)移操作需注意移液器槍頭不要觸碰到白膜細(xì)胞層和暗紅色沉淀。

1.3.3磁珠法抽提cfDNA 取1 mL血漿樣品按照游離DNA提取試劑盒的說明書要求進(jìn)行cfDNA的提取,對制造商推薦的方案稍加修改,將蛋白酶K 60 ℃處理時間從10 min增加到1 h,使與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)降解,DNA充分游離,以逆轉(zhuǎn)化學(xué)固定的影響。用55 μL預(yù)熱緩沖液洗脫cfDNA,并在-80 ℃條件下保存。

1.3.4血漿總cfDNA水平檢測 使用Thermo NanoDrop OneC分光光度計檢測從血漿中提取的總cfDNA水平。

1.3.5實時熒光定量PCR(q-PCR)定量檢測cfDNA水平 采用q-PCR方法,通過已知濃度Leptin基因標(biāo)準(zhǔn)品CT 值與其濃度的對數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,準(zhǔn)確定量人Leptin基因166 bp片段在不同時間點的水平變化來研究血漿中cfDNA的水平變化趨勢,上游引物和探針的序列來自參考文獻(xiàn)[10],下游引物使用Primer Premier 5軟件設(shè)計的序列。Leptin上游引物:5′-CAGTCTCCTCCAAACAGAAAGTCA-3′,下游引物:5′-CGGAGGTTCTCCAGGTCGTTGGATA-3′;Taqman探針:5′-(FAM)bCGGTTTGGACTTC(MGBNFQ) -3′。

Leptin標(biāo)準(zhǔn)品、引物和探針均由上海生工生物工程股份有限公司合成,標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋成2×102~2×108copy/mL,引物和探針的終濃度為500 nmol/L。體系中引入UDG酶和熱啟動DNA聚合酶,預(yù)防PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染,抑制在低溫條件下的非特異性擴(kuò)增,兩種酶在體系總的量為0.5 U和2.0 U。PCR反應(yīng)采用20 μL的反應(yīng)體系,PCR熱循環(huán)條件:50 ℃ 2 min,94 ℃ 10 min,94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s共45個循環(huán)。每個標(biāo)本設(shè)置3個復(fù)孔,設(shè)置3個無模板對照孔。

2 結(jié) 果

2.1血漿總cfDNA水平的檢測結(jié)果 血液采集到采血管后,室溫保存2 h、4 d、7 d、10 d、14 d、15 d,采血管中血漿總cfDNA的水平變化呈現(xiàn)出明顯差異(表1)。EDTA-K2抗凝管中總cfDNA水平在室溫存放至4 d時,與2 h總cfDNA水平相比降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=45.727,P=0.014)。儲存7~15 d時,與2 h總cfDNA水平相比升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩種cfDNA專用采血管中的血漿總cfDNA水平在10 d內(nèi)保持穩(wěn)定,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同采血管對血漿總DNA水平保存效果的影響

2.2q-PCR檢測不同保存時間血液標(biāo)本cfDNA水平 血液標(biāo)本采集到3種采血管后室溫存放2 h、4 d、7 d、10 d、14 d、15 d,cfDNA水平有差異,結(jié)果如圖1。EDTA-K2抗凝管中的血漿cfDNA在4、7、10、14、15 d時,相較于2 h時的水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),整個儲存周期cfDNA水平波動式上升。兩種專用采血管中的血漿cfDNA水平在4、7 d時,相較于2 h的水平略微降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);在10、14、15 d時的血漿cfDNA水平,相較于2 h 的水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

注:E為EDTA-K2抗凝管,K為專用采血管K,A為專用采血管A。

3 討 論

cfDNA作為新的生物標(biāo)志物,其水平和組分的穩(wěn)定性對后期的臨床檢測至關(guān)重要。無創(chuàng)產(chǎn)前診斷、胎兒性別的確定[9]、腫瘤學(xué)監(jiān)測及RhD陰性母親的RhD基因型檢測是cfDNA檢測的主要應(yīng)用領(lǐng)域[10]。有效利用cfDNA靶點作為生物標(biāo)志物的一個主要技術(shù)挑戰(zhàn)是對稀有靶點進(jìn)行量化,由于cfDNA的水平在血漿中的比例非常低,血漿分離離心力過大,白細(xì)胞破裂釋放DNA,都會進(jìn)一步減少胎兒或者腫瘤來源cfDNA的比例[11-12],最小化白細(xì)胞的破裂和核酸酶的降解是穩(wěn)定保存血液標(biāo)本中目標(biāo)cfDNA比例的有效方式。cfDNA專用采血管的應(yīng)用很大程度上解決了血液保存時間的限制,使得缺乏相應(yīng)提取和檢測設(shè)備的地區(qū)能夠進(jìn)行異地血樣檢測。

q-PCR是目前定量檢測cfDNA水平的主要方法,檢測機(jī)體中廣泛分布且穩(wěn)定出現(xiàn)的靶序列,定量分析cfDNA的水平變化。Leptin基因位于7號染色體上,且存在于所有人體細(xì)胞中,通過血漿中Leptin基因的水平變化能夠反映不同采血管對cfDNA保存效果的影響。

本研究對比了EDTA-K2抗凝管與cfDNA專用采血管對于cfDNA保存效果的影響,EDTA-K2抗凝管中cfDNA的水平在第7、10、14、15天明顯升高,表明在血液標(biāo)本的長期保存過程中不斷有內(nèi)源DNA釋放造成的污染,在第4天,cfDNA水平降低,表明在EDTA-K2抗凝管血液保存前期,核酸酶對cfDNA的降解作用強(qiáng)于內(nèi)源DNA的污染,與之相反的兩種專用采血管中cfDNA水平保持穩(wěn)定,且有逐漸減少的趨勢,證明專用采血管對穩(wěn)定血液標(biāo)本中cfDNA水平在一定時間內(nèi)有積極的作用,專用采血管能穩(wěn)定有核血細(xì)胞,減少內(nèi)源DNA的釋放,抑制核酸酶對cfDNA的降解作用,從而保持總cfDNA水平的穩(wěn)定。

通過q-PCR檢測血漿中提取的cfDNA,EDTA-K2抗凝管中的血漿cfDNA在4、7、10、14、15 d時,相較于2 h時的水平明顯升高,表明cfDNA受到基因組DNA的污染,不同長度片段的分布和比例發(fā)生變化,與已有的研究結(jié)果一致[13]。兩種專用保存管中,cfDNA在保存至4 d和7 d時,cfDNA的水平穩(wěn)定,保存至10、14、15 d時,cfDNA的水平明顯降低,表明兩種專用采血管能保持cfDNA水平穩(wěn)定至少7 d,血液有核細(xì)胞的破裂和核酸酶對DNA的降解過程被有效抑制,10、14、15 d時,cfDNA水平降低暗示核酸酶對DNA的降解起到了主導(dǎo)作用。

綜上所述,專用采血管能夠抑制基因組DNA釋放到血漿,同時保持最初的cfDNA水平,對血液標(biāo)本保存過程中cfDNA的穩(wěn)定起到積極的作用,穩(wěn)定有核血細(xì)胞,抑制核酸酶的降解活性,對于cfDNA的后續(xù)分析和作為生物標(biāo)志物準(zhǔn)確檢測奠定了基礎(chǔ)。

猜你喜歡
核酸酶專用血漿
糖尿病早期認(rèn)知功能障礙與血漿P-tau217相關(guān)性研究進(jìn)展
體能測試專用鞋
體能測試專用鞋
體能測試專用鞋
血漿置換加雙重血漿分子吸附對自身免疫性肝炎合并肝衰竭的細(xì)胞因子的影響
含季銨鹽的芳酰腙配體的銅 (Ⅱ)配合物的合成和表征:體外DNA鍵合和核酸酶活性
金黃色葡萄球菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性研究
多種Cas12a蛋白變體能識別不同的PAM序列(2020.4.27 Plant Biotechnology Journal)
愛它就給它專用的設(shè)備
用megaTAL 核酸酶對原代人T 細(xì)胞CCR5 基因座進(jìn)行有效修飾可建立HIV-1 抵抗力
西安市| 二手房| 沂源县| 宜州市| 莱阳市| 朔州市| 耒阳市| 五大连池市| 常山县| 开阳县| 绥中县| 台江县| 井陉县| 巴东县| 禄丰县| 特克斯县| 怀宁县| 武平县| 常德市| 华蓥市| 井研县| 江安县| 汉川市| 镇平县| 永川市| 安义县| 手机| 雅安市| 江西省| 宜兰市| 陇川县| 永春县| 无极县| 邵阳市| 呼和浩特市| 玛纳斯县| 沾化县| 华容县| 昌吉市| 元江| 奎屯市|