董世鵬，樸忠萬，金志民，張雋晟

（牡丹江師范學院，黑龍江牡丹江 157012）

褐家鼠分布范圍廣、繁殖能力強、破壞力大、疫病傳染率高，已成為危害性最大的鼠種之一[1]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMPs）是轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β超家族中最大的亞族，由Urist等研究人員首次于1965年從脫鈣骨基質(zhì)中分離得到[2]。研究表明，BMPs在大部分脊椎動物組織中均有不同程度的表達，其主要誘導胚胎發(fā)育過程中成骨及軟骨的形成和修復，在神經(jīng)組織、眼組織、泌尿、臟器等器官中起到定性、重塑的作用[3-5]。BMP4是BMPs家族中的一員，具有BMPs保守結構，研究人員發(fā)現(xiàn)BMP4參與調(diào)節(jié)細胞的分化及凋亡，并在形成配子方面起著重要作用[6-7]，在小鼠中發(fā)現(xiàn)的BMP4可以促進其卵泡的形成及轉(zhuǎn)化[8]。本試驗以褐家鼠尾上表皮轉(zhuǎn)錄組為參考，篩選到RnBMP4基因的cDNA序列，利用生物信息學方法對RnBMP4蛋白的理化性質(zhì)、跨膜結構、二級結構、三級結構、蛋白質(zhì)修飾位點及同源性等方面進行分析，為研究鼠類RnBMP4功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 基因序列的獲取

褐家鼠RnBMP4的cDNA序列從褐家鼠尾部皮膚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得。以下16種動物RnBMP4氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得：屋頂鼠（Rattus rattus，XP_032773996.1）、小家鼠（Mus musculus，AAC37698.1）、錫金小鼠（Mus pahari，XP_021059014.1）、卡氏小鼠（Mus caroli，XP_021037499.1）、非洲樹線鼠（Grammomys surdaster，XP_028614463.1）、白鼻乳鼠（Mastomys coucha，XP_031218030.1）、尼羅壟鼠（Arvicanthis niloticus，XP_034355193.1）、草原田鼠（Microtus ochrogaster，XP_026639058.1）、南蝗鼠（Onychomys torridus，XP_036055299.1）、亞洲水牛（Bubalus bubalis，NP_001277806.1）、白尾鹿（Odocoileus virginianus texanus，XP_020743815.1）、野牦牛（Bos mutus，XP_014335672.1）、以色列鼴鼠（Nannospalax galili，XP_008837774.1）、綿羊（Ovis aries，NP_001103747.1）、中國地鼠（Cricetulus griseus，XP_035309221.1）、蒼白矛吻蝠（Phyllostomus discolor，XP_028361956.1）。

1.2 分析方法

褐家鼠RnBMP4蛋白的生物信息學分析內(nèi)容和使用的軟件及網(wǎng)站如表1所示。

表1 RnBMP4蛋白的生物信息學分析方法

2 結果與分析

2.1 RnBMP4理化性質(zhì)分析

利用ProtParam軟件對褐家鼠RnBMP4氨基酸序列進行理化分析，結果如圖1所示。RnBMP4基因cDNA共編碼408個氨基酸，分子量46 529.72 D，理論等電點為8.57，該蛋白中含量最多的為亮氨酸，占比9.3%；含量最少的為色氨酸，占比為1.5%（圖1a）。分子式為C2046H3203N615O598S17，負電荷殘基總數(shù)為45，正電荷殘基總數(shù)為49，總原子數(shù)6 479，不穩(wěn)定指數(shù)為61.40，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，脂肪系數(shù)為76.67。ProtScale軟件分析，最大值為2.978，最小值為-3.556（圖1b），故該蛋白為親水蛋白。

圖1 RnBMP4氨基酸組成和親水性/疏水性分析

2.2 RnBMP4信號肽和跨膜結構

RnBMP4蛋白信號肽和跨膜結構域預測結果如圖2所示。使用SignalP-4.1預測RnBMP4蛋白含有信號肽，位點在第23個氨基酸處（圖2a），但是該蛋白不存在跨膜結構（圖2b）。

圖2 RnBMP4蛋白信號肽和跨膜結構域預測

2.3 RnBMP4結構域預測

蛋白保守序列分析如圖3所示，RnBMP4含有TGFb前肽超家族（ID：cd19391），其第41～276氨基酸之間為TGFb-propeptide的保守結構域；同時，還是BMP4超家族（ID：pfam00688），在302～408氨基酸之間，含有BMP4保守結構域。

圖3 蛋白保守序列分析

2.4 RnBMP4二級、三級結構預測

利用SOPMA對RnBMP4的二級結構進行分析，結果如圖4a所示。該蛋白22.30%可能會形成螺旋（Helix），18.63%可能形成延伸鏈（Strand），1.96%可能形成轉(zhuǎn)角（Turn），57.11%為無規(guī)卷曲（Random coil），無二硫鍵的形成，沒有特殊的二級結構。用SWISS-MODEL對RnBMP4蛋白進行三級結構的預測，結果如圖4b所示：在第41～408氨基酸之間含有功能保守結構域。

圖4 RnBMP4蛋白結構預測

2.5 蛋白質(zhì)修飾位點的預測

通過Predict Protein預測分析：RnBMP4含有4個糖基化位點、5個酪蛋白磷酸激酶Ⅱ磷酸化位點、1個cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點、5個蛋白激酶C磷酸化位點。

2.6 氨基酸序列同源性對比

在NCBI數(shù)據(jù)庫中分別下載16種動物的BMP4序列，與褐家鼠RnBMP4氨基酸序列進行同源性分析，結果如圖5所示：褐家鼠RnBMP4與屋頂鼠（Rattus rattus）及錫金小鼠（Mus pahari）親緣關系較近，而與其他動物親緣關系較遠。

圖5 RnBMP4系統(tǒng)進化樹分析結果

3 結論

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMPs）作為動物組織中重要的轉(zhuǎn)化生長因子，其廣泛存在于動物體中，在早期胚胎發(fā)育至成年期均有不同程度的表達[9]。本研究從褐家鼠尾部皮膚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得并篩選出其序列信息，結果表明：RnBMP4蛋白共編碼408個氨基酸，該蛋白中含量最多的為亮氨酸，屬于不穩(wěn)定親水蛋白；含有信號肽但無跨膜結構，分別含有TGFb前肽超家族（ID：cd19391）及BMP4超家族（ID：pfam00688）的保守結構域；二級結構以無規(guī)則卷曲結構為主；經(jīng)MAGA5.1分析，褐家鼠RnBMP4與屋頂鼠及錫金小鼠親緣關系較近，以上結果為進一步研究褐家鼠RnBMP4基因功能提供了一定的理論基礎。