田向?qū)W，董志民，李富強(qiáng)，任衛(wèi)科，池晶晶，張 莉，張 蕾，崔尚金，鄢明華*

(1.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)天津科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，天津 300381；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

豬鏈球菌(Streptococcussuis，SS)是豬鏈球菌病的病原，可引起病豬表現(xiàn)腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥和肺炎等多種癥狀。SS為革蘭氏陽性球菌，多呈鏈狀排列，無芽孢，能形成莢膜。根據(jù)菌體莢膜多糖結(jié)構(gòu)的不同，SS分為33個血清型(1-31型，33型，1/2型)[1]，其中SS1/2、SS1、SS2、SS7和SS9型菌株的臨床分離率較高，而且不同血清型在我國不同地區(qū)的分布和范圍均有不同[2-5]。不同血清型的SS臨床分離株中，2型菌株的毒力最強(qiáng)，是一種重要的人獸共患病病原[6]。

國內(nèi)外對SS毒力因子及致病機(jī)制的研究大多集中在2型SS，對于8型SS主要局限于流行病學(xué)調(diào)查[7-8]。本實(shí)驗(yàn)室從天津地區(qū)的發(fā)病豬組織病料中分離到1株SS，經(jīng)鑒定為血清8型。通過對該分離菌株的培養(yǎng)特性、生化特性、耐藥性和致病力等特性研究，為進(jìn)一步研究SS 8型的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，為臨床開展豬鏈球菌病的防控與治療提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 天津地區(qū)某豬場送檢疑似豬鏈球菌病例發(fā)病豬組織病料。

1.1.2 主要試劑 premixTaq(RR901A)，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；哥倫比亞血瓊脂平板(200508)，比克曼生物科技有限公司產(chǎn)品；THB培養(yǎng)基(HB0311-3)，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，Gibico胎牛血清(A3160801)，上海覓拓生物科技有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片(C074)、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管(A203)，均為杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；SS8型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(Z126)，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 垂直層流潔凈工作臺(HCB-1300)，青島海爾特種電器有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱(ZXMP-A1430)，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；臺式離心機(jī)(TGL-16M)，湘儀離心機(jī)儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；Applied Biosystems Veriti熱循環(huán)儀器(4452299)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品；伯樂凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc 2 000)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；細(xì)菌濁度儀(WGZ-2XJ)，上海昕瑞儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動物 18 g～20 g清潔級昆明小鼠，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的初步分離 無菌采集發(fā)病豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)液等，接種于哥倫比亞血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18 h，選取疑似鏈球菌形態(tài)的菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，挑選革蘭氏陽性、鏈狀或成雙存在的單個菌落進(jìn)行菌株純化，用含50 mL/L胎牛血清的THB培養(yǎng)液培養(yǎng)已純化菌株，用400 mL/L的甘油保存菌液，備用。

1.2.2 16S rDNA基因PCR鑒定 取上述保存菌液100 μL接種于10 mL THB培養(yǎng)液，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，制備菌液樣品。以細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌液樣品全基因組DNA為模板，參照文獻(xiàn)[5,9]委托北京六合華大基因科技股份有限公司合成豬鏈球菌16S rDNA特異性鑒定引物(表1)，采用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95℃ 5 min，(94℃ 30 s，Tm 30 s，72℃ 30 s)×30循環(huán)，72℃ 7 min，16℃終止。PCR產(chǎn)物應(yīng)用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果陽性的產(chǎn)物回收后送天津金唯智生物科技有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對分析。

1.2.3 生化試驗(yàn) 取分離菌株THB培養(yǎng)物和高壓滅菌去離子水(陰性對照)各 20 μL，分別接種于細(xì)菌微量生化反應(yīng)管中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)菌微量生化反應(yīng)管的顏色變化，分析菌株生化反應(yīng)特性。

1.2.4 血清型鑒定

1.2.4.1 玻片凝集試驗(yàn) 參照GB/T 19915.2-2005《豬鏈球菌2型分離鑒定操作規(guī)程》[10]中平板凝集試驗(yàn)操作規(guī)程：取上述保存菌液30 μL接種于3 mL THB培養(yǎng)液(含50 mL/L胎牛血清)，于37℃搖床，振蕩培養(yǎng)18 h。取1.5 mL培養(yǎng)物，經(jīng)10 000 r/min離心3 min后棄上清，用100 μL生理鹽水將沉淀懸浮。取25 μL菌懸液分別和等體積理鹽水、SS 8型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清作玻片凝集試驗(yàn)，其中生理鹽水作為陰性對照并觀察待檢菌株是否有自凝現(xiàn)象。在生理鹽水對照不凝集，陽性菌株凝集的情況下，4 min內(nèi)若待檢菌株出現(xiàn)肉眼可見凝集則為陽性。

1.2.4.2 菌體莢膜多糖基因PCR鑒定 參考文獻(xiàn)[11]合成我國已報道的 SS 血清型(1、2、3、7、8、9、21型)PCR 鑒定引物(表1)，以上述提取的分離株DNA為模板，采用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：95℃ 5 min，(94℃ 30 s，Tm 30 s，72℃ 30 s)×30循環(huán)，72℃ 7 min，16℃終止。PCR產(chǎn)物應(yīng)用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，檢測產(chǎn)物送天津金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序，對測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對分析。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法，將純化后的菌株接種于含20 mL/L牛血清的THB營養(yǎng)肉湯，于37℃搖床振蕩培養(yǎng)18 h，滅菌生理鹽水調(diào)整濁度為0.5 MCF的菌液均勻涂布于哥倫比亞血瓊脂平板上，37℃靜置培養(yǎng)24 h后，參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會標(biāo)準(zhǔn)(CLSI)對結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.2.6 致病力試驗(yàn)

1.2.6.1 菌液的制備 將純化后的菌種接種于含有50 mL/L胎牛血清的THB培養(yǎng)液中，于37℃搖床振蕩培養(yǎng)18 h，6 000 r/min離心10 min，棄去上清，用THB培養(yǎng)液重懸菌沉淀。參照文獻(xiàn)[9]取200 μL菌懸液加THB培養(yǎng)液至2 mL配制成菌懸液，并進(jìn)行10倍倍比稀釋，以平板表面涂布法計數(shù)菌落總數(shù)(CFU/mL)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果將菌懸液稀釋至合適濃度備用。

1.2.6.2 動物分組及感染試驗(yàn) 選取60只18 g～20 g清潔級昆明小鼠隨機(jī)分為7組，其中攻菌組分為5組，每組10只，滅菌THB培養(yǎng)液組和空白對照組各5只。參考前期的試驗(yàn)結(jié)果[12]，采用腹腔注射方式，注射劑量為1 mL/只，分離菌株的攻菌劑量分別為4.0×108CFU/mL、2.0×108CFU/mL、1.0×108CFU/mL、5.0×107CFU/mL和2.5×107CFU/mL。攻菌后連續(xù)觀察12 d，記錄小鼠臨床癥狀、發(fā)病率和死亡率，按照(LD50=lg-1[Xm-i(∑P-0.5)])[13]方法計算分離菌株對昆明小鼠的半數(shù)致死量(LD50)。小鼠死亡后，及時采集心、肝、脾、腦組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、染色、鏡檢及cps8K基因PCR檢測。

1.2.7 毒力基因檢測 參考文獻(xiàn)[14-15]合成SS 7個主要毒力基因(gdh、gapdh、sly、fbps、orf2、epf和mrp)，以上述提取的分離株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物序列見表2，引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL)：模板0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，premixTaq酶10 μL，高壓滅菌水8.5 μL；反應(yīng)條件：95℃ 5 min，(95℃ 30 s；退火Tm 30 s，72℃延伸1 min)×30個循環(huán)；72℃ 7 min，16℃終止(不同毒力基因的退火溫度Tm參考表2)。擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用10 g/L的瓊脂糖核酸凝膠電泳進(jìn)行檢測，將篩選出的特異性目的片段樣品進(jìn)行產(chǎn)物回收、測序，依據(jù)核苷酸比對結(jié)果進(jìn)行分析。

表2 豬鏈球菌主要毒力基因檢測PCR擴(kuò)增引物序列

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

從發(fā)病豬肝臟、肺臟、淋巴、脾臟等病料中均可分離到比較純凈的細(xì)菌，分離菌株在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，菌落呈針尖大小、灰白半透明、表面光滑、中間隆起且伴隨α溶血狀態(tài)。挑取疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，結(jié)果顯示分離菌呈革蘭氏染色陽性，以多個圓形或卵圓形構(gòu)成的短鏈形式存在(圖1)。將分離菌株分別命名為TJS31。

圖1 分離菌株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果(100×)

2.2 16S rDNA基因鑒定

PCR結(jié)果顯示，陽性條帶大小為1 500 bp(圖2)。將PCR產(chǎn)物測序后經(jīng)Blast比對(圖3)，該菌株的16S rDNA序列與GenBank中已發(fā)表的豬鏈球菌序列同源性為99.84%～100.00%。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.TJS31株；2.陽性對照；3.陰性對照

圖3 TJS31株16S rDNA核苷酸序列比對結(jié)果

2.3 生化特性鑒定

生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株可發(fā)酵麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、菊糖、棉子糖、七葉苷、淀粉；不發(fā)酵甘露醇、山梨醇、阿拉伯糖，并且觸酶試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)均為陰性；不能利用甘油、硫化氫、馬尿酸鹽；在400 mL/L膽汁肉湯和65 g/L高鹽肉湯中不生長。

2.4 血清型鑒定結(jié)果

2.4.1 玻板凝集試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株與8型SS標(biāo)準(zhǔn)陽性血清出現(xiàn)明顯的凝集顆粒(圖4)，與其他血清型的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清均無凝集現(xiàn)象。

1.生理鹽水+TJS31菌液；2.SS 8標(biāo)準(zhǔn)陽性血清+TJS31菌液

2.4.2 PCR鑒定 以SS的不同血清特異性分型引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果只有SS 8型特異性引物擴(kuò)增出目的條帶(圖5)，其他引物均未擴(kuò)出目的條帶，結(jié)合平板凝集試驗(yàn)結(jié)果，表明該分離株為血清型8型豬鏈球菌。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陰性對照；2.TJS31菌株

2.5 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示，TJS31株僅對磺胺間甲氧嘧啶鈉敏感，對氨芐西林、頭孢曲松鈉、卡那霉素中介，對阿莫西林、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、強(qiáng)力霉素、林可霉素、慶大霉素、紅霉素、氯霉素耐藥(表4)。

表3 TJS31株生化試驗(yàn)結(jié)果

表4 TJS31菌株的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 致病力試驗(yàn)結(jié)果

4.0×108CFU/mL 感染劑量下，試驗(yàn)組小鼠感染6 h即出現(xiàn)精神萎靡、扎堆現(xiàn)象，24 h內(nèi)出現(xiàn)死亡，小鼠死亡前表現(xiàn)為呼吸急促，發(fā)抖、運(yùn)動遲緩；在24 h之后，試驗(yàn)期內(nèi)死亡的小鼠主要表現(xiàn)為不同程度的精神萎靡、被毛粗亂、呼吸急促、眼球混濁等癥狀；隨后，部分小鼠出現(xiàn)一過性神經(jīng)癥狀，5 d后小鼠逐漸康復(fù)，14 d后部分小鼠留有眼球混濁、頭歪等后遺癥。對死亡小鼠及時剖檢，從心血、肺、肝、脾均能分離培養(yǎng)出大量菌落形態(tài)單一的病菌，經(jīng)染色、鏡檢為鏈球菌，PCR方法檢測cps8K基因?yàn)殛栃?圖6)，根據(jù)改良寇氏法計算，TJS31菌株對昆明小鼠的LD50為1.8×108CFU/mL。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陰性對照；2.TJS31菌株；3.小鼠體內(nèi)分離菌株

2.7 毒力基因檢測結(jié)果

結(jié)果顯示(圖7)，TJS31株攜帶的毒力基因有sly、gdh、orf2、gapdh。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.orf2；2.sly；3.gapdh；4.gdh；5.陰性對照

表5 TJS31對昆明小鼠的致病力試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

近年來，國內(nèi)學(xué)者陸續(xù)報道在疑似豬鏈球菌病例發(fā)病豬病料中分離到SS8型，表明該血清型SS在國內(nèi)的流行呈擴(kuò)散趨勢。同時，有報道表明在健康豬群內(nèi)也分離到8型SS[16-18]。目前，國內(nèi)對于SS8型的研究僅停留在流行病學(xué)調(diào)查階段，對其攜帶的毒力基因和致病力相關(guān)研究較少。

SS致病性強(qiáng)弱與其攜帶的毒力基因密切相關(guān)，其中cps、mrp、epf和sly是強(qiáng)毒株的標(biāo)志[19]。國外研究發(fā)現(xiàn)，SS2菌株致病性最強(qiáng)的毒力基因型為cps2+/epf+/mrp+/sly+，趙冉對25株SS2國內(nèi)分離株攜帶的毒力基因的檢測結(jié)果顯示，96%的菌株表現(xiàn)為cps2+/gdh+/epf+/mrp+/sly+/fbps+/orf2+毒力基因型[20]。迄今，國內(nèi)尚無關(guān)于SS8型攜帶毒力基因研究的報道。本研究對SS8型天津分離株TJS31攜帶的毒力基因進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)該菌株攜帶強(qiáng)毒力基因sly，毒力基因型為sly+/gdh+/orf2+/gapdh+。研究結(jié)果有助于了解豬鏈球菌不同血清型菌株之間毒力基因分布差異，為進(jìn)一步研究這些毒力基因與SS8型致病力的相關(guān)性奠定了基礎(chǔ)。

應(yīng)用小鼠感染性試驗(yàn)評價SS致病力強(qiáng)弱的研究很多，陳申申報道SS強(qiáng)毒株對小鼠的LD50處于1×106CFU/mL～1×108CFU/mL區(qū)間[21]。WEI等研究SS2型分離菌株對小鼠致病力，認(rèn)為5×108CFU/mL接種劑量下，引起50%小鼠死亡的菌株為強(qiáng)毒株；3×109CFU/mL接種劑量下50%小鼠死亡的菌株為中等毒力毒株[22]。本研究分離的SS8天津分離株TJS31株對昆明小鼠感染性試驗(yàn)結(jié)果表明，TJS31株的LD50為1.8×108CFU/mL，毒力較強(qiáng)。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，TJS31株對13種受試藥物中的12種均不敏感，表現(xiàn)為多重耐藥特性，值得提高警惕。建議養(yǎng)豬場根據(jù)流行菌株的耐藥情況，選擇敏感的藥物用于豬鏈球菌病的防治，并通過減少抗菌藥物的使用量、交替用藥等方式，科學(xué)合理的使用抗菌藥物，遏制病原細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。

本研究從臨床發(fā)病豬中分離、鑒定的8型豬鏈球菌，具有較強(qiáng)的多重耐藥特性，毒力基因型為sly+/gdh+/orf2+/gapdh+。雖然該菌株不攜帶強(qiáng)致病性毒力基因epf和mrp，但其LD50依然可以達(dá)到1.8×108CFU/mL，致病力較強(qiáng)。