王 健，王 剛，王可良

（天津市西青醫(yī)院骨一科，天津 300380）

腰椎退行性變（lumbar degeneration）是常見(jiàn)的骨科疾病，包含腰椎管狹窄癥、腰椎間盤(pán)突出癥、退行性腰椎滑脫、退行性脊柱側(cè)凸多種不同類型的疾病，其中腰椎管狹窄癥和腰椎間盤(pán)突出癥在臨床最為多見(jiàn)。腰椎管狹窄癥典型表現(xiàn)為間歇性跛行，腰椎間盤(pán)突出癥典型表現(xiàn)為下肢放射性疼痛。目前對(duì)腰椎間盤(pán)退變機(jī)制的研究很多，主要有化學(xué)性神經(jīng)根炎癥、機(jī)械性壓迫、椎間盤(pán)自身免疫等學(xué)說(shuō)，但對(duì)其確切的發(fā)病機(jī)制尚未明確[1-4]。腰痛和下肢神經(jīng)根性痛癥狀的嚴(yán)重程度不僅與腰脊髓神經(jīng)受突出間盤(pán)壓迫的位置及程度相關(guān)，一部分患者腰椎MRI 檢查可見(jiàn)腰脊髓神經(jīng)受壓嚴(yán)重，但臨床癥狀表現(xiàn)較輕。分子生物學(xué)研究證實(shí)[5，6]，退變椎間盤(pán)組織中多種炎癥因子的表達(dá)增高，進(jìn)一步研究證實(shí)，白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）及環(huán)氧化酶2（COX-2）等炎性因子可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)并加快腰椎間盤(pán)的退變過(guò)程。基于此，本研究通過(guò)分析不同類型腰椎退行性變患者椎間盤(pán)組織中白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素1β、環(huán)氧化酶2 表達(dá)的相關(guān)性和差異性，探討其在腰椎間盤(pán)退變過(guò)程中的作用，及其與癥狀嚴(yán)重程度的相關(guān)性，為闡明腰椎間盤(pán)退變的發(fā)病機(jī)制及指導(dǎo)臨床治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017 年7 月～2018 年11 月于天津市西青醫(yī)院行腰椎后路間盤(pán)切除內(nèi)固定術(shù)的退變椎間盤(pán)組織（L2/3～L5/S1）標(biāo)本60 例，其中腰椎管狹窄癥組30 例，腰椎間盤(pán)突出癥組30 例。腰椎管狹窄癥組中男12 例，女18 例，年齡27～55 歲，平均年齡（48.12±8.40）歲。腰椎間盤(pán)突出癥組中男14 例，女16 例，年齡29～67 歲，平均年齡（50.24±10.18）歲。所有患者均符合腰椎管狹窄癥及腰椎間盤(pán)突出癥的典型臨床癥狀、體征，且與影像學(xué)檢查結(jié)果相符。另收集同時(shí)間段因外傷致腰椎骨折患者的椎間盤(pán)組織（L1/2～L3/4）30 例作為腰椎外傷組，其中男11 例，女19例，年齡23～58 歲，平均年齡（30.52±9.78）歲，均無(wú)腰椎外傷史及手術(shù)史，椎間盤(pán)Thompson’s 退變分級(jí)為1～2 級(jí)。腰椎間盤(pán)突出癥組及腰椎管狹窄癥組影像學(xué)表現(xiàn)為單節(jié)段或多節(jié)段的椎間盤(pán)突出，手術(shù)切除的椎間盤(pán)均為責(zé)任間盤(pán)。腰椎管狹窄癥組取得椎間盤(pán)節(jié)段，L2/35 例，L3/415 例，L4/525 例，L5/S123 例。腰椎間盤(pán)突出癥組取得椎間盤(pán)節(jié)段，L3/43 例，L4/512 例，L5/S115 例。腰椎外傷組取得椎間盤(pán)節(jié)段，L1/220 例，L2/39 例，L3/41 例。對(duì)所納入研究的患者術(shù)前均已履行告知義務(wù)，告知其術(shù)中切除的椎間盤(pán)組織將用于實(shí)驗(yàn)研究，取得其同意并簽署知情同意書(shū)，同時(shí)獲得天津市西青醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。本實(shí)驗(yàn)忽略納入的實(shí)驗(yàn)對(duì)象性別與年齡所產(chǎn)生的誤差。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本獲取 腰椎管狹窄癥組及腰椎間盤(pán)突出癥組行后入路腰椎間盤(pán)切除椎間植骨融合內(nèi)固定術(shù)，切除責(zé)任間盤(pán)作為標(biāo)本，椎間隙植骨并鎖緊內(nèi)固定物。腰椎外傷組行前入路腰椎間盤(pán)切除骨折復(fù)位椎間植骨融合內(nèi)固定術(shù)，切除部分椎間盤(pán)作為標(biāo)本，置入內(nèi)固定螺釘系統(tǒng)并撐開(kāi)復(fù)位骨折，椎間隙內(nèi)植骨并鎖緊內(nèi)固定物。所有患者均由同一手術(shù)組醫(yī)生完成手術(shù)操作。將術(shù)中所得標(biāo)本以生理鹽水沖洗，去除其表面的碎骨、血液等非椎間盤(pán)組織，截取髓核與纖維環(huán)交界部位1 cm 標(biāo)本，1 h 內(nèi)以10%福爾馬林固定24 h，石蠟包埋后制備4 μm 的軟組織切片，0 ℃～4 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 染色觀察 將得到的組織切片常溫二甲苯脫蠟4 min×3 次，脫蠟后的切片依次放置于濃度為100%、95%、90%、80%、70%的酒精中各5 min 梯度逐級(jí)水化，蒸餾水沖洗4 min×3 次。以3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，浸泡8 min，PBS 沖洗4 min×3 次。高壓高溫修復(fù)抗原，將切片置入枸櫞酸鹽緩沖液（pH=6.0）中，加熱至沸騰3 min，冷卻至室溫后用PBS 洗滌4 min×3 次。每張切片滴加適當(dāng)稀釋過(guò)的一抗，4 ℃過(guò)夜，用PBS 代替一抗作陰性對(duì)照；加入0.025% Triton/TBS 稀釋的二抗（HRP 標(biāo)記），37 ℃雜交2h，TBS 洗滌2 次，每次5min；DAB 室溫顯色10min，蘇木精復(fù)染1 min，自來(lái)水沖洗。在100 倍鏡下隨機(jī)選取6 個(gè)視野觀察，細(xì)胞核呈藍(lán)色、細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色為陽(yáng)性，觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度及是否有新生血管形成。白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6、環(huán)氧化酶2 的表達(dá)情況按如下標(biāo)準(zhǔn)判定：在400 倍鏡下隨機(jī)選取20 個(gè)視野進(jìn)行觀察，細(xì)胞核或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性。所有使用的一抗購(gòu)于Abcam。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組免疫化學(xué)染色陽(yáng)性數(shù)據(jù)以（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組病理表現(xiàn) 腰椎管狹窄癥組和腰椎間盤(pán)突出癥組椎間盤(pán)組織周?chē)难仔匀庋拷M織中可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)以及新生血管形成，陽(yáng)性細(xì)胞以成纖維紐胞、軟骨細(xì)胞及淋巴細(xì)胞為主；腰椎外傷組未見(jiàn)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)以及新生血管形成。免疫化學(xué)染色顯示，腰椎管狹窄癥組及腰椎間盤(pán)突出癥組中均可見(jiàn)白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6 表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，主要分布于椎間盤(pán)髓核、纖維環(huán)內(nèi)環(huán)及椎間盤(pán)周?chē)难仔匀庋拷M織內(nèi)，在腰椎間盤(pán)突出癥組可見(jiàn)大量環(huán)氧化酶2 表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，且在纖維環(huán)破裂髓核脫出的標(biāo)本中尤為顯著，在腰椎管狹窄癥組中相對(duì)較少，兩組中表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的分布情況與前基本相同；在腰椎外傷組中上述炎性因子表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞稀少，見(jiàn)圖1。

2.2 三組白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6、環(huán)氧化酶2陽(yáng)性表達(dá)率比較 腰椎管狹窄癥組及腰椎間盤(pán)突出癥組中白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6、環(huán)氧化酶2的陽(yáng)性表達(dá)率均高于腰椎外傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；腰椎管狹窄癥組與腰椎間盤(pán)突出癥組中白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6 的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；腰椎間盤(pán)突出癥組環(huán)氧化酶2 的陽(yáng)性表達(dá)率高于腰椎管狹窄癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

圖1 腰椎外傷組、腰椎管狹窄癥組、腰椎間盤(pán)突出癥組椎間盤(pán)組織病理表現(xiàn)

表1 三組IL-1β、IL-6 及COX-2 陽(yáng)性表達(dá)率比較（%）

3 討論

椎間盤(pán)是位于脊柱上下椎體之間的果凍樣彈性組織，由髓核、纖維環(huán)及上下軟骨終板構(gòu)成，其主要作用是在軸向上承受并緩沖向下傳導(dǎo)的力學(xué)負(fù)荷。椎間盤(pán)的退變是脊柱退行性變病程中首先發(fā)生的病理過(guò)程，部分研究表明椎間盤(pán)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞是導(dǎo)致椎間盤(pán)退變的首要原因[7]。椎間盤(pán)是一個(gè)無(wú)血管器官，髓核被纖維環(huán)和終板包繞，與機(jī)體免疫系統(tǒng)隔離，被認(rèn)為是機(jī)體的免疫赦免區(qū)。在正常狀態(tài)下，由于動(dòng)態(tài)壓力的作用，髓核通過(guò)軟骨終板內(nèi)的毛細(xì)血管與微孔與機(jī)體進(jìn)行代謝物質(zhì)交換，其內(nèi)部應(yīng)保持低氧、低pH、低細(xì)胞密度環(huán)境，維持椎間盤(pán)內(nèi)穩(wěn)態(tài)主要靠結(jié)構(gòu)的完整及代謝的平衡。隨著年齡增長(zhǎng)，髓核內(nèi)水分持續(xù)丟失，新合成的細(xì)胞基質(zhì)逐漸減少，導(dǎo)致椎間盤(pán)承受應(yīng)力的能力逐漸減弱，最終負(fù)荷超過(guò)承受極限而導(dǎo)致纖維環(huán)破裂、髓核突出，內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡被打破。破裂的椎間盤(pán)與機(jī)體免疫系統(tǒng)接觸，即會(huì)發(fā)生炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生的炎性因子刺激椎間盤(pán)組織產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（ADAMTs），加速基質(zhì)降解，進(jìn)一步促進(jìn)椎間盤(pán)退變過(guò)程[8]。研究表明，退變椎間盤(pán)組織中有大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，且多種炎性因子的表達(dá)增高，這些炎性因子可作用于周?chē)募顾琛⑸窠?jīng)根或脊神經(jīng)節(jié)發(fā)生炎性反應(yīng)[6]。

白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6 和環(huán)氧化酶2 是重要的炎癥細(xì)胞因子，很多研究證實(shí)其與腰椎退行性變患者的臨床癥狀有密切關(guān)系，但目前無(wú)明確量化研究[9，10]。白細(xì)胞介素1β 是白細(xì)胞介素1 的一種亞型（其余兩種亞型為白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素1受體拮抗劑），作為關(guān)鍵促炎性炎性因子在椎間盤(pán)退變炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)與趨化作用中起到重要作用[11]。實(shí)驗(yàn)表明，在椎間盤(pán)細(xì)胞中加入白細(xì)胞介素1β 可破壞椎間盤(pán)基質(zhì)合成與分解代謝的平衡，促進(jìn)椎間盤(pán)基質(zhì)降解，進(jìn)而加速椎間盤(pán)退變，椎間盤(pán)纖維環(huán)出現(xiàn)裂隙后滲漏的炎性因子可刺激纖維環(huán)內(nèi)的疼痛感受器，引起腰痛等臨床癥狀[12，13]。白細(xì)胞介素6 作為重要的炎癥遞質(zhì)也在腰椎間盤(pán)退變過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明，在發(fā)生退行性變的腰椎間盤(pán)組織中可檢測(cè)到白細(xì)胞介素6 的存在，且其分泌量與白細(xì)胞介素1β 的刺激呈正相關(guān)。白細(xì)胞介素6 作為“下游”炎癥因子，可刺激炎性細(xì)胞聚集激活及炎性遞質(zhì)的釋放，促進(jìn)椎間盤(pán)細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，加速椎間盤(pán)基質(zhì)降解，破壞椎間盤(pán)“穩(wěn)態(tài)”，改變其物理及生化特性，與白細(xì)胞介素1β 共同完成椎間盤(pán)退變的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[11]。同時(shí)白細(xì)胞介素6 可通過(guò)具有調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，可誘發(fā)椎間盤(pán)的自身免疫反應(yīng)[14]。在本研究中，對(duì)椎間盤(pán)組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色后，腰椎管狹窄癥組腰椎間盤(pán)突出癥組中均可見(jiàn)大量白細(xì)胞介素1β 及白細(xì)胞介素6 表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，且兩組間陽(yáng)性表達(dá)率基本一致，而腰椎外傷組表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞稀少，因此考慮白細(xì)胞介素1β與白細(xì)胞介素6 主要作用于腰椎退變過(guò)程。

新生血管形成在退變椎間盤(pán)的自發(fā)性吸收過(guò)程中起關(guān)鍵作用，環(huán)氧化酶2 作為前列腺類炎癥因子被花生四烯酸催化過(guò)程的限速酶，可通過(guò)調(diào)節(jié)前列腺類炎癥因子的表達(dá)誘導(dǎo)新生血管的形成，同時(shí)抑制椎間盤(pán)組織內(nèi)蛋白多糖的合成，在椎間盤(pán)退變過(guò)程中起重要作用[15]。同時(shí)，環(huán)氧化酶2 作為局部炎癥反應(yīng)的特異性因子，通過(guò)前列腺素E2 等炎癥因子的表達(dá)，可增強(qiáng)神經(jīng)末梢感受器的敏感性,降低組織痛閾值，使其處于痛敏狀態(tài)，從而增強(qiáng)并延長(zhǎng)5-羥色胺、組胺等炎性因子的致痛作用[16]。環(huán)氧化酶2 在正常椎間盤(pán)中幾乎不表達(dá)，而在退變椎間盤(pán)內(nèi)可陽(yáng)性表達(dá)[12]。在本研究中，腰椎間盤(pán)突出癥組椎間盤(pán)組織中可見(jiàn)大量環(huán)氧化酶2 表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，且在纖維環(huán)破裂髓核脫出的標(biāo)本中尤為顯著，腰椎管狹窄癥組中相對(duì)較少，腰椎間盤(pán)突出癥組中環(huán)氧化酶2表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞稀少，考慮環(huán)氧化酶2 參與腰椎間盤(pán)退變的過(guò)程，但其高表達(dá)的主要刺激因素為局部炎癥反應(yīng)。

綜上所述，發(fā)生退行性變的腰椎間盤(pán)組織中存在白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6 和環(huán)氧化酶2 細(xì)胞因子表達(dá)，并在腰椎間盤(pán)早期退變中發(fā)揮作用；另外，不同類型的腰脊髓神經(jīng)壓迫患者白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6 和環(huán)氧化酶2 的表達(dá)存在一定差異。