趙長海，張辰銘，孫春陽，郭文博，王 強，焦成斌

（1.佳木斯市中心醫(yī)院普外科，黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院普外科，黑龍江 佳木斯 154002）

甲狀腺癌（thyroid carcinoma，TC）是一種內分泌系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率逐年增加，以女性較為多見，其中90%以上為分化型甲狀腺癌[1，2]。近年來對甲狀腺癌的研究表明多種基因表達異常與其惡性生物學特點密切相關，然而對于甲狀腺癌的具體發(fā)病分子機制尚未完全明確。人類P53 位于染色體17p13.1，目前已證實其在多種進展期、轉移性腫瘤（腦腫瘤、乳腺癌、子宮內膜癌、前列腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌等）中發(fā)生高頻率突變或缺失是一種普遍現象[3]。突變型P53 具有抑制野生型P53 的功能，可使DNA的修復、促進細胞凋亡、細胞周期阻滯、調節(jié)代謝等腫瘤抑制功能喪失，同時還可促進腫瘤成形，這種突變體被稱為TP53[4]。人類Wnt-5a 位于染色體3p14-21，是人體生長發(fā)育和病理修復過程中的一個關鍵因子，研究表明[5，6]，各種蛋白質能結合細胞膜表面不同的Wnt-5a 受體，在細胞內復雜的蛋白網絡中參與細胞的分裂與凋亡。目前有關TP53、Wnt-5a 在甲狀腺癌中表達模式及其與甲狀腺癌臨床病理分期關系的研究較少，基于此，本研究主要分析不同臨床分期的甲狀腺癌中TP53 和Wnt-5a 的表達特點，探討其在甲狀腺癌中表達的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2004 年7 月～2013 年9 月佳木斯市中心醫(yī)院經過病理證實的50 例甲狀腺癌組織、10 例癌旁正常腺體組織的石蠟標本及23 例甲狀腺癌組織、10 例癌旁正常腺體組織的新鮮標本。石蠟標本中男性15 例，女性35 例，年齡20～77 歲，中位年齡41 歲；手術新鮮組織標本中男性13 例，女性20 例，年齡27～67 歲，中位年齡52 歲；依據美國腫瘤聯(lián)合協(xié)會（AJCC）進行臨床分期[7，8]：石蠟標本中甲狀腺癌Ⅰ～Ⅱ期14 例、Ⅲ～Ⅳ期36 例。新鮮組織標本中甲狀腺癌Ⅰ～Ⅱ期7 例、Ⅲ～Ⅳ期16 例。

1.2 主要試劑及器材 TP53 突變兔抗人多克隆抗體從上海蘭頓生物技術股份有限公司購買，兔抗人的Wnt-5a 多克隆抗體購自上海蘭頓生物科技有限公司，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒購自北京翰譜醫(yī)藥生物研究所。β-actin、辣根過氧化物酶標記IgG 抗體、BCA、SDS-PAGE kit、考馬斯亮藍染色液、DNA和蛋白電泳標記Marker，ECL 超敏反應發(fā)光液、純硝酸纖維素膜、麗春紅染色被購自北京博奧生物有限公司。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（北京中杉金橋生物技術有限公司）、PCR 儀（美國應用生物系統(tǒng)公司型號：9800）、分析軟件和凝膠圖像分析系統(tǒng)BTNTA2020D（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）。PBS 1 L、0.01 mol/L 檸檬酸鹽液、0.5 mol/L EDTA 緩沖液（pH 8.0）、1 mol/L 的TBS 緩沖液（pH 8.0）、酶消化液、封片劑。通過NCBI 中GeneBank 搜索框查詢到P53 的order cDNA 框中顯示P53 引物5-TCTGTCACTTGCACGTACTC-3，下游引物：5 端-CACGGATGTGAAGGGTGAAA-3 端。Wnt-5a 引物序 列：5-GACCTGGTCTACAT-CGACCCC-3 端，5端-GCAGCACCAGTGGAACTTGCA-3 端，引物合成由上海生物工程公司合成，擴增產物長度分別為348 bp、214 bp。β-actin 上游引物：5 端-ACCACCATGTACACAGGCAT-3 端，下游引 物：5 端-CTCTCTTTGCACTCACTAGGGG-3 端，擴增產物長度為150 bp。

1.3 免疫組織化學 SP 法：①脫蠟、水化；②PBS 洗2～3 次，各5 min；③3%二氧化氫滴加在切片上，室溫下放置10 min 左右；④PBS 洗2～3 次，各5 min；⑤微波爐中抗原修復；⑥PBS 洗2～3 次，各5 min；⑦在每張病理切片中滴加適量的山羊血清封閉液，室溫放置19 min，甩去多余液體；⑧滴加相應需要檢測的TP53或Wnt-5aⅠ抗50 μl，室溫環(huán)境下靜置1 h，4 ℃過夜或者37 ℃1 h；⑨4 ℃過夜后在37 ℃復溫45 min；⑩PBS 洗3 次，各5 min；每張切片中加入39～45 μlⅡ抗液，37 ℃條件下放置1 h；PBS 洗3 次，各5 min；DAB 液分別滴加D、A、B，5～10 min 后在顯微鏡下根據情況調整染色程度；PBS 或自來水沖洗10 min；染色結束后蘇木精復染3 min，后用鹽酸酒精分化；自來水沖洗10～15 min；脫水、透明、封片、鏡檢。免疫組化染色結果判定：TP53 定位主要位于細胞核以染色結果目的蛋白出現黃或棕色顆粒為陽性，陰性為陽性細胞＜25%，陽性為陽性細胞＞25%，隨機選擇5 個高倍視野，計數1000 個細胞。

1.4 反轉錄PCR 總RNA 提?。孩偃?00 mg 組織，放到1.5 ml EP 管中，在低溫條件下加入1 ml Trizol剪碎；②對EP 管中的組織震蕩30 s；③加入0.3 ml體積的氯仿，均勻充分搖動30 s 左右，室溫下放置3 min；④8000×g，4 ℃離心，15 min；⑤吸掉上層無色水相，然后移入另一無菌EP 管中（約0.6 ml）；⑥加等體積異丙醇，-20 ℃，30 min；⑦8000×g，4 ℃離心，10 min，在EP 管底部可見微量RNA 的沉淀；⑧去掉EP 管中上清液，加75%乙醇1 ml 后振蕩；⑨7500×g，4 ℃離心，10 min；⑩棄上清，用濾紙小心吸取殘留液體，室溫干燥5～10 min；沉淀溶于20 μl DEPC 水，取1 μl 加入79 μl DEPC 水測OD260/OD280；計算濃度與純度，-70 ℃保存。逆轉錄合成cDNA 反應體系：氯化鎂、buffer、RNase-free dH2O、dntp、混合液、RNase 抑制劑、amv RNA transrciptase、random9 mers、positive control RNA 總體積10 μl，離心后反應條件：30 ℃、41 ℃、95 ℃、5 ℃。PCR 反應：加入PCR 目的基因引物、模版cDNA、RNA tap 聚合酶、PCR buffer、滅菌蒸餾水，總反應體積13 μl，混勻快速離心1 次，反應條件：95 ℃、94 ℃、95 ℃、57 ℃、71 ℃、72℃，共35 個循環(huán)。PCR 產物-20 ℃冰箱保存取PCR 產物8 μl 加5×Loading Buffer 2 μl 2%，通過110 V，95 mA 的電泳后，采用相應的染色劑（溴化乙錠）對跑完后電泳的凝膠進行著色，凝膠成象儀成象之后在電腦桌面上點擊并保存，通過密度分析軟件對測出各泳帶的吸光度值，以目的基因和βactin mRNA 吸光度比值進行mRNA 半定量分析。

1.5 統(tǒng)計學方法 數據資料進行整理后錄入Excel 表格，采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料以（）表示，比較采用t檢驗；計數資料以[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗。采用Pearson 相關性分析甲狀腺癌中TP53 與Wnt-5a mRNA 的關系。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TP53 蛋白、Wnt-5a 蛋白在甲狀腺癌與癌旁組織中的表達 甲狀腺癌TP53 陽性表達率為58.00%（29/50），高于癌旁組織的20.00%（2/10），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中甲狀腺癌中Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期TP53 陽性表達率分別為35.71%（5/14）、66.67%（24/36），二者比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。甲狀腺癌Wnt-5a 陽性表達率為40.00%（20/50），低于癌旁組的70.00%（7/10），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中甲狀腺癌中Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期Wnt-5a 陽性表達率分別為64.29%（9/14）、30.56%（11/36），二者比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖1 TP53 在甲狀腺癌及癌旁組織中的表達

圖2 Wnt-5a 在甲狀腺癌及癌旁組織中的表達

2.2 TP53 mRNA、Wnt-5a mRNA 在甲狀腺癌與癌旁組織中的表達分析 甲狀腺癌TP53 mRNA 表達量為（0.54±0.040），高于癌旁組的（0.32±0.030），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中甲狀腺癌組Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期TP53 mRNA 表達量分別為（0.48±0.022）、（0.58±0.032），二者比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。甲狀腺癌Wnt-5a mRNA 表達量為（0.51±0.079），低于癌旁組的（0.79±0.028），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中甲狀腺癌Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期Wnt-5a mRNA 表達量分別為（0.71±0.036）、（0.50±0.053），二者比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 甲狀腺癌中TP53 與Wnt-5a mRNA 的關系Pearson 相關性分析顯示，甲狀腺癌中TP53 與Wnt-5a mRNA 呈負相關（r=-0.720，P＜0.05）。

3 討論

P53 是一個癌癥抑制蛋白質，在腫瘤調控過程中以及人體代謝、發(fā)育過程中具有重要作用。目前TP53 在國內的研究主要集中在卵巢癌，肺腺癌、肝癌、乳腺癌/三陰乳腺癌、膀胱癌、結直腸癌、胃癌等惡性腫瘤中的蛋白表達特性，研究認為[9-12]，P53 和VEGF、P16、PAX2、PTEN、VHL、細胞增殖相關抗原、細胞周期素、缺氧誘導因子-1α、細胞增殖相關蛋白、Mir-34 家族在腫瘤中協(xié)同表達，導致了腫瘤細胞復雜的生物學特性，但是卻較少從信號轉導的角度研究P53 與信號轉導途徑的關系。有研究報道[13]，TP53 對ID4 基因表達具有促進作用。人類Wnt-5a轉錄并翻譯生成的成熟蛋白是人體生長發(fā)育和病理修復過程中的一個關鍵因子，并參與細胞變化調控，若Wnt-5a 異常變化則會導致細胞增殖特性改變，進而出現增殖失控或增殖抑制。

本研究通過免疫組織化學技術和RT-PCR 在蛋白和mRNA 層面檢測甲狀腺癌中的TP53 的表達，結果顯示甲狀腺癌TP53 陽性表達率為58.00%（29/50），高于癌旁組織的20.00%（2/10），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中甲狀腺癌中Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期TP53 陽性表達率分別為35.71%（5/14）、66.67%（24/36），二者比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示高表達TP53 蛋白參與或者在腫瘤的發(fā)生中具有重要作用。此外，甲狀腺癌TP53 mRNA 表達量為（0.54±0.040），高于癌旁組的（0.32±0.030），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中甲狀腺癌組Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期TP53 mRNA 表達量分別為（0.48±0.022）、（0.58±0.032），二者比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這種mRNA 表達的差異性與蛋白表達差異和模式相同，提示甲狀腺癌TP53 的異常增高在轉錄和翻譯兩個層面參與了腫瘤的進展。

腫瘤的發(fā)生是一個多步驟多因素的過程，本研究通過免疫組織化學技術和RT-PCR 檢測在甲狀腺癌中的Wnt-5a 的差異表達，結果顯示甲狀腺癌Wnt-5a 陽性表達率為40.00%（20/50），低于癌旁組的70.00%（7/10），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中甲狀腺癌中Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期Wnt-5a 陽性表達率分別為64.29%（9/14）、30.56%（11/36），二者比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明Wnt-5a 在甲狀腺癌組的陽性表達率低于癌旁組陽性表達率以及隨甲狀腺癌的高分期，其總體陽性率較低。此外，甲狀腺癌Wnt-5a mRNA 表達量為（0.51±0.079），低于癌旁組的（0.79±0.028），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中甲狀腺癌Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期Wnt-5a mRNA 表達量分別為（0.71±0.036）、（0.50±0.053），二者比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且相關性分析顯示，甲狀腺癌中TP53 與Wnt-5a mRNA 呈負相關（r=-0.720，P＜0.05）。由于腫瘤分期越高往往提示腫瘤惡性程度以及侵襲性越高，這些結果顯示Wnt-5a 在甲狀腺癌的發(fā)生過程中可能有抑制癌細胞生長和轉移、促進細胞分化的作用。

綜上所述，TP53 和Wnt-5a 基因的表達參與了甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展，同時Wnt-5a 激活的信號轉導途徑可能在臨床甲狀腺癌的治療中具有輔助作用，二者聯(lián)合檢測對臨床手術方式、術后治療策略選擇、預后評估具有重要的價值。