白靜茹，白 力，張文蘭

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.包頭醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕免疫研究所；3.內(nèi)蒙古自體免疫學(xué)重點實驗室)

RA是一種慢性自身免疫性疾病，以侵蝕性、對稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞，最終發(fā)展成關(guān)節(jié)畸形和功能喪失，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。蒙醫(yī)中RA屬于托列病的范疇。近期多種研究發(fā)現(xiàn)蒙藥具有治愈率高、不易復(fù)發(fā)、副作用小等特點，因此蒙藥用于防治RA具有良好的發(fā)展前景。

那如三味丸，又稱那如蘇木珠爾，由訶子，蓽撥，制草烏組成，具有祛風(fēng)，止痛，散寒作用，可用于治療風(fēng)濕、關(guān)節(jié)疼痛、白喉等癥，是蒙醫(yī)臨床常用蒙藥之一。有研究發(fā)現(xiàn)，在佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant arthritis, AA)動物模型中，那如三味丸有明顯的治療作用，能夠減輕大鼠足腫脹程度并降低炎性因子水平[2]。此外，在臨床研究中，使用那如三味丸治療RA能夠緩解關(guān)節(jié)破壞，延緩疾病進(jìn)展，且無明顯藥物不良反應(yīng)[3]。其治療RA療效雖然明確，但是其靶點及作用機制尚有待探究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)于2007年被提出，是建立在高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、虛擬計算及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索基礎(chǔ)上，基于藥物、成分、靶點之間的關(guān)聯(lián)性，通過生物信息網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，構(gòu)建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)；基于藥物與藥物之間的相同成分、功效和內(nèi)在結(jié)構(gòu)，構(gòu)建“藥物-藥物”網(wǎng)絡(luò)，探索藥物有效成分的具體作用靶點和藥物功效。綜上，本次研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法全面解析那如三味丸治療RA的機制，為后期生物學(xué)驗證提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1那如三味丸活性成分信息及作用靶點的獲取 從TCMSP數(shù)據(jù)庫[4]獲得那如三味丸的化合物信息，并以“經(jīng)口服生物利用度”(OB)≥30%、“類藥性指數(shù)”(DL)≥0.18為條件篩選化合物，將篩選出的藥物活性成分以Smile ID格式輸入到SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫[5]，預(yù)測化合物的作用靶點，選取基因疾病多效性指數(shù)(Disease pleiotropy index for the gene, DPI)大于0.75的靶點，保留靶點Uniprot ID、名稱等信息。

1.2RA靶點的獲取 在DisGeNET數(shù)據(jù)庫[6]中輸入“Rheumatoid arthritis”，獲取RA相關(guān)靶點，將上述獲得的化合物作用靶點與RA靶點進(jìn)行匹配，篩選出共同靶點，得到那如三味丸治療RA的潛在靶點。

1.3蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析 將潛在靶點信息導(dǎo)入到String數(shù)據(jù)庫[7]，獲得靶點間的蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，導(dǎo)出圖片。

1.4網(wǎng)絡(luò)分析及Hub節(jié)點選擇 將潛在靶點的Uniprot ID導(dǎo)入到Cytoscape軟件的GO插件中，種屬設(shè)置為“Homo sapiens”，設(shè)置P≤0.05，選擇Molecular Function、Biological Process、Immune System Process分析及KEGG分析，應(yīng)用氣泡圖和Cytoscape進(jìn)行可視化處理。應(yīng)用CytoHubba插件在靶點通路圖中篩選關(guān)鍵靶點及通路。

2 結(jié)果

2.1那如三味丸治療RA的潛在靶點 根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫收錄情況，結(jié)合OB及DL篩選，找到那如三味丸化學(xué)成分29個，應(yīng)用化合物分子結(jié)構(gòu)在SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶點，并與DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲得的RA靶點進(jìn)行匹配，獲得那如三味丸治療RA的潛在靶點106個，根據(jù)DPI排序。見表1。

表1 那如三味丸治療RA的潛在靶點

55CYP2C19P33261cytochrome P450 family 2 subfamily C member 190.85756PPARGP37231peroxisome proliferator activated receptor gamma0.85757MAPK1P28482mitogen-activated protein kinase 10.85758CYP2C9P11712cytochrome P450 family 2 subfamily C member 90.85759JUNP05412Jun proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit0.85760BCL2L1Q07817BCL2 like 10.85761TERTO14746telomerase reverse transcriptase0.85762HPRT1P00492hypoxanthine phosphoribosyltransferase 10.85763PLATP00750plasminogen activator, tissue type0.85764HPGDSO60760hematopoietic prostaglandin D synthase0.85765FGF2P09038fibroblast growth factor 20.85766SIRT1Q96EB6sirtuin 10.85767CASP8Q14790caspase 80.85768MCL1Q07820BCL2 family apoptosis regulator0.85769MAPK3P27361mitogen-activated protein kinase 30.85770BRAFP15056B-Raf proto-oncogene, serine/threonine kinase0.85771CCR2P41597C-C motif chemokine receptor 20.85772CFTRP13569cystic fibrosis transmembrane conductance regulator0.85773DNMT1P26358DNA methyltransferase 10.85774APPP05067amyloid beta precursor protein0.85775SHHQ15465sonic hedgehog0.85776PPARAQ07869peroxisome proliferator activated receptor alpha0.85777PTPN22Q9Y2R2protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 220.82178ALOX5P09917arachidonate 5-lipoxygenase0.82179DHFRP00374dihydrofolate reductase0.82180STSP08842steroid sulfatase0.82181TYMSP04818thymidylate synthetase0.82182MMP1P03956matrix metallopeptidase 10.82183VCAM1P19320vascular cell adhesion molecule 10.82184NR3C1P04150nuclear receptor subfamily 3 group C member 10.82185SELEP16581selectin E0.82186NFKBIAP25963NFKB inhibitor alpha0.82187ESR2Q92731estrogen receptor 20.82188PTGS1P23219prostaglandin-endoperoxide synthase 10.82189CCR3P51677C-C motif chemokine receptor 30.82190CYP19A1P11511cytochrome P450 family 19 subfamily A member 10.82191PGRP06401progesterone receptor0.82192GSTK1Q9Y2Q3glutathione S-transferase kappa 10.82193PLGP00747plasminogen0.82194NR1I2O75469nuclear receptor subfamily 1 group I member 20.82195FLT1P17948fms related tyrosine kinase 10.82196EDNRAP25101endothelin receptor type A0.82197PTPN11Q06124protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 110.82198CASP1P29466caspase 10.82199GSTM2P28161glutathione S-transferase mu 20.821100RAF1P04049Raf-1 proto-oncogene, serine/threonine kinase0.821101EDNRBP24530endothelin receptor type B0.821102ELANEP08246elastase, neutrophil expressed0.821103EZH2Q15910enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit0.821104FGFR1P11362fibroblast growth factor receptor 10.821105MAP2K1Q02750mitogen-activated protein kinase kinase 10.821106CDC42P60953cell division cycle 420.821

2.2靶點PPI網(wǎng)絡(luò) 將106個交集靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中，設(shè)置種屬為人類，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。圖中MAPK1、MAPK3、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白-3(Signal transducer and activator of transcription-3, STAT-3)、表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR)在網(wǎng)絡(luò)中自由度較高。見圖1。

2.3網(wǎng)絡(luò)分析 將106個靶點的Uniprot ID導(dǎo)入Cytoscape的GO插件中，進(jìn)行Molecular Function、Biological Process、Immune System Process分析，獲得靶點相關(guān)功能。應(yīng)用氣泡圖對靶點參與的功能及生物過程進(jìn)行可視化處理并對靶點基因參與的免疫過程進(jìn)行分析。見圖2，圖3，表2。

圖1 那如三味丸治療RA的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 那如三味丸靶點基因的主要功能

圖3 那如三味丸靶點基因參與的生物過程

2.4信號通路分析及Hub節(jié)點選擇 將靶點導(dǎo)入KEGG數(shù)據(jù)庫，獲得靶點參與信號通路信息，應(yīng)用Cytoscape建立靶點-信號通路圖；應(yīng)用CytoHubba插件對網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，篩選得到Hub節(jié)點，排名前3的信號通路為PI3K-Akt信號通路、趨化因子信號通路、HIF-1信號通路，關(guān)鍵靶點為MAPK1和MAPK3。見圖4，圖5。

表2 那如三味丸靶點基因參與的免疫過程

圖4 那如三味丸靶點-信號通路圖

圖5 那如三味丸治療RA的關(guān)鍵靶點及通路

3 討論

RA是由T細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等進(jìn)入關(guān)節(jié)腔誘導(dǎo)的持續(xù)炎癥[8-9]。由于其發(fā)病機制復(fù)雜，常用的藥物以單一靶點治療RA療效欠佳，而蒙藥具有多途徑、多靶點治療RA的作用特點，可發(fā)揮較好的治療效果。本研究首先通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測到那如三味丸治療RA的106個靶點，并通過String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，獲得靶點間相互作用關(guān)系。在106個靶點中，MAPK1、MAPK3、STAT3、EGFR、AKT1與多種蛋白存在緊密聯(lián)系，且炎癥相關(guān)靶點Toll樣受體-4(Toll-like receptor 4, TLR-4)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶-2(Prostaglandin-endoperoxide synthase 2, PTGS2)、核因子κB1(Nuclear factor kappa-B1, NF-κB1)在網(wǎng)絡(luò)中自由度較高[10-12]。前期研究發(fā)現(xiàn)那如三味丸可通過miR-250a/P65途徑發(fā)揮抗炎作用[13]，與本研究預(yù)測靶點相同，證明了結(jié)果的可靠性；應(yīng)用GO分析，發(fā)現(xiàn)那如三味丸治療RA的靶點通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)肽受體活性、PI3K活性等功能發(fā)揮治療作用；靶點通過參與細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中涉及的細(xì)胞因子產(chǎn)生等29種生物過程及白細(xì)胞分化、巨噬細(xì)胞分化等6種免疫過程來影響RA的進(jìn)展；應(yīng)用KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)靶點參與PI3K-AKT信號通路、趨化因子信號通路、HIF-1信號通路等與RA密切相關(guān)的信號通路22條，最終確定的關(guān)鍵靶點及通路包括：MAPK1、MAPK3、PI3K-Akt信號通路、趨化因子信號通路及HIF-1信號通路。

關(guān)鍵靶點中MAPK1/ERK2和MAPK3/ERK1是ERK信號通路的關(guān)鍵蛋白，ERK信號通路為MAPK經(jīng)典信號通路，通過磷酸化激活的級聯(lián)反應(yīng)對炎癥起到調(diào)控作用。以往研究發(fā)現(xiàn)，ERK信號通路可介導(dǎo)RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖，參與RA進(jìn)展[14]；中藥復(fù)方二妙散可抑制ERK信號通路靶向治療RA[15]，與此相同。本研究預(yù)測那如三味丸可通過MAPK1、MAPK3抑制ERK信號通路，從而抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞增殖。

關(guān)鍵通路中，PI3K-Akt信號通路與RA多種病理過程密切相關(guān)，由于該通路可作用多種不同的底物，決定了PI3K-Akt信號通路功能的多樣性。研究發(fā)現(xiàn)通路在RA中以NF-κB為底物可增加抑瘤素M(Oncostatin M, OSM)的表達(dá)，OSM可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)并影響成骨細(xì)胞功能[16]；Tian等[17]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過抑制PI3K-Akt信號通路降低腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNFα)誘導(dǎo)的白介素1-β(Interleukin 1-β, IL-1β)及基質(zhì)金屬蛋白酶3(Matrix metalloproteinase 3, MMP3)的表達(dá)。本研究結(jié)果預(yù)測那如三味丸可能靶向PI3K-Akt信號通路發(fā)揮治療意義。趨化因子信號通路是與RA密切相關(guān)的信號通路，RA發(fā)生后滑膜組織大量表達(dá)趨化因子，趨化淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的遷移，誘導(dǎo)持續(xù)的炎癥發(fā)生，因此以趨化因子信號通路為靶點，可減輕滑膜組織的炎癥反應(yīng)。關(guān)鍵信號通路HIF-1在RA的血管翳形成中發(fā)揮重要作用，RA關(guān)節(jié)腔內(nèi)存在缺氧情況[18]，缺氧誘導(dǎo)的HIF-1信號通路可促進(jìn)血管翳形成，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)病變及軟骨破壞，因此那如三味丸可能通過HIF-1信號通路減少血管翳的形成，延緩疾病的進(jìn)展。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法全面分析了蒙藥那如三味丸治療RA的作用機制，通過分析發(fā)現(xiàn)那如三味丸可通過MAPK1、MAPK3、EGFR、AKT、STAT3等靶點，發(fā)揮抗炎、減少血管翳形成等作用，干預(yù)RA的發(fā)生發(fā)展，研究結(jié)果為臨床用藥提供了更多理論支持，同時為后續(xù)的基礎(chǔ)研究提供了可靠靶點。