王海霞，趙其平，朱順海，黃 兵，董 輝，王青杰，余水蘭，于 鈺,2，梁珊珊,2，韓紅玉

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.上海師范大學(xué)，上海200241）

雞球蟲病（coccidiosis）是由一種或多種艾美耳屬球蟲（Eimeria spp.）寄生于雞腸道不同部位所引起的一種腸道細(xì)胞內(nèi)寄生性原蟲病[1]。在各種雞病中，球蟲病的發(fā)病率最高，約占1/6～1/5，其發(fā)病率高達(dá)50%～60%，病死率達(dá)40%～80%，雞球蟲病至今仍然是一個(gè)全球性的對(duì)養(yǎng)雞業(yè)危害嚴(yán)重的疾病，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道，全球每年因球蟲病造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)30億美元，我國年養(yǎng)肉雞約30～60億羽，每年用于抗球蟲病的費(fèi)用高達(dá)6～18億[2]。目前有不同的策略來控制家禽養(yǎng)殖場中的球蟲病，例如改善衛(wèi)生和管理、使用抗球蟲藥或應(yīng)用各種類型的抗球蟲疫苗[3]。目前，在飼料和飲水中添加預(yù)防性藥物仍是控制全球球蟲病最廣泛使用的方法。抗球蟲藥通常分為聚醚離子載體類和化學(xué)合成類藥物。聚醚離子載體類藥物包括鹽霉素（saliniomycin）、馬杜拉霉素（madubamycin ammonium）、莫能菌素（monensin）等，該類藥物以離子的形式作用于雞腸道的細(xì)胞膜上，穿過細(xì)胞膜后，將藥物滲透到有球蟲的地方，破壞球蟲細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡，使球蟲細(xì)胞內(nèi)進(jìn)入大量的陽離子或者水分子，最終因過度腫脹而亡?；瘜W(xué)合成類藥物包括地克珠利（diclazuril）、磺胺氯吡嗪（sulfaclozine）、尼卡巴嗪（nicarbazin）、氯苯胍（robenidine）等，不同的抗球蟲藥物作用方式不同，包括阻礙能量代謝（喹諾酮、尼卡巴嗪等），影響輔助因子的合成（磺胺類、氨丙啉等）和DNA的合成（氟嘌呤類）等，如磺胺類藥物通過與對(duì)氨基苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶（dihydrofolate synthetase）妨礙二氫葉酸的形成從而抑制球蟲的正常發(fā)育，對(duì)所有球蟲的第2代裂殖子最為有效。不同的抗球蟲藥物對(duì)艾美耳球蟲的作用方式和靶向發(fā)育階段不同[4]。

任何一種抗球蟲藥的長期使用，都不可避免地會(huì)引起球蟲產(chǎn)生耐藥性。自1954年，美國首次分離出了對(duì)磺胺類有耐藥性的蟲株。迄今為止，人們幾乎分離獲得了所有抗球蟲藥物的耐藥株。

鹽霉素屬于聚醚離子載體類抗生素，對(duì)尚未進(jìn)入腸細(xì)胞內(nèi)的球蟲子孢子具有高度殺滅作用，作用于無性生殖階段，對(duì)裂殖體具有很強(qiáng)的抑制作用[5]。鹽霉素對(duì)預(yù)防由柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）、毒害艾美耳球蟲（E. necatrix）、巨型艾美耳球蟲（E. maxima）和堆型艾美耳球蟲（E. acervulina）引起的球蟲病有效。同時(shí)，鹽霉素可提高飼料的轉(zhuǎn)化效率和增重率。其作用機(jī)理是促使鈉離子和水過多地進(jìn)入球蟲細(xì)胞使其破裂。各國學(xué)者陸續(xù)報(bào)道了由于鹽霉素的廣泛使用而引起的田間球蟲對(duì)鹽霉素的耐藥性。黃兵等[6-8]發(fā)現(xiàn)田間分離株對(duì)鹽霉素具有一定程度的耐藥。由于養(yǎng)雞場廣泛使用抗球蟲藥，且長期使用一種藥物，因此現(xiàn)場分離的鹽霉素耐藥株大都對(duì)其他藥物也出現(xiàn)耐藥，調(diào)查中同時(shí)發(fā)現(xiàn)，上海分離的野生株在對(duì)鹽霉素耐藥的同時(shí)，對(duì)莫能菌素也耐藥，但鹽霉素的耐藥機(jī)理仍不是很清楚。為進(jìn)一步研究球蟲對(duì)鹽霉素產(chǎn)生耐藥性的機(jī)理，本研究在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了柔嫩艾美耳球蟲（E. tenella）鹽霉素耐藥株的誘導(dǎo)試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用艾拔益加（AA）肉雞，購自上海奉賢區(qū)某種雞場，出殼日運(yùn)至上海獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，在網(wǎng)上隔離飼養(yǎng)，飼料、籠具均經(jīng)消毒。14日齡感染前連續(xù)2 d檢查糞便有無卵囊。確認(rèn)無球蟲感染后，方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 柔嫩艾美耳球蟲蟲株 上海獸醫(yī)研究所球蟲實(shí)驗(yàn)室保存3個(gè)月內(nèi)的柔嫩艾美耳球蟲敏感株（資源號(hào)：CAAS21111601）。

1.3 試驗(yàn)藥物 0.5%地克珠利，浙江匯能生物股份有限公司生產(chǎn)，使用有效劑量1 mg/kg，生產(chǎn)批號(hào)：416420608；6%癸氧喹酯，浙江匯能生物股份有限公司生產(chǎn)，使用有效劑量27 mg/kg，生產(chǎn)批號(hào)：416112905；鹽酸氯苯胍，浙江匯能生物股份有限公司生產(chǎn)，使用有效劑量60 mg/kg，生產(chǎn)批號(hào)：316111605；甲基鹽霉素，上海禮來動(dòng)物保健有限公司生產(chǎn)，使用有效劑量80 mg/kg，生產(chǎn)批號(hào)：C625940；12%鹽霉素，山東勝利生物工程有限公司生產(chǎn)，使用有效劑量：60 mg/kg，生產(chǎn)批號(hào)：SSP121801030。

1.4 鹽霉素耐藥株的實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)

1.4.1 誘導(dǎo)方法 采用藥物濃度逐漸遞增的方法對(duì)柔嫩艾美耳球蟲藥物敏感株進(jìn)行人工誘導(dǎo)，每次藥物誘導(dǎo)組所收集的卵囊供下一次感染。根據(jù)相對(duì)卵囊產(chǎn)量和耐藥性程度，逐漸提高藥物濃度，直至誘導(dǎo)出鹽霉素耐藥性蟲株。當(dāng)藥物濃度提高后，若盲腸病變不夠嚴(yán)重，收集不到足以傳代的卵囊，則重復(fù)原藥物濃度傳代。

1.4.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 取14日齡無球蟲雛雞，淘汰偏重與偏輕的雞，每組7只雞，隨機(jī)分成3組：飼料中添加鹽霉素1組、感染不用藥和不感染不用藥各1組。15日齡時(shí)，除不感染不用藥組外，其余2組均經(jīng)口感染柔嫩艾美耳球蟲敏感株孢子化卵囊8×104個(gè)/只，接種后第8 d，剖殺所有試驗(yàn)雞，收集盲腸，用研缽在重鉻酸鉀中研磨盲腸，至腸壁中大部分未孢子化卵囊釋放出來，收集后在28℃培養(yǎng)孢子化卵囊供下一次傳代用。誘導(dǎo)成功后為更加準(zhǔn)確判斷所獲得的耐藥株是否為完全耐藥株，進(jìn)行動(dòng)物藥敏試驗(yàn)檢測誘導(dǎo)蟲株的耐藥程度。

1.5 誘導(dǎo)后蟲株的耐藥性檢測

1.5.1 試驗(yàn)分組 試驗(yàn)共分14組，分別是地克珠利組、癸氧喹酯組、鹽酸氯苯胍組、甲基鹽霉素組、鹽霉素組、感染不用藥組、不感染不用藥組（健康組），每組6只，各組均重復(fù)一次。

1.5.2 試驗(yàn)步驟 于12日齡開始試驗(yàn)，逐只稱重，隨機(jī)分組，并調(diào)整各組體重基本相同，用藥組開始喂含推薦濃度藥物的飼料至試驗(yàn)結(jié)束。13日齡，除不感染不用藥組外，每只雞經(jīng)嗉囊接種8×104個(gè)經(jīng)人工誘導(dǎo)的對(duì)60 mg/kg鹽霉素耐藥的柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊。感染后第5 d，檢查血便，參照文獻(xiàn)[9]的方法記分，并記錄雞只死亡情況。感染后第6～8 d，收集糞便，用麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)板計(jì)算每克糞便卵囊數(shù)（oocysts per gramme，OPG），觀察雞只情況和糞便變化情況。感染第8 d，全部試驗(yàn)雞單只稱重，計(jì)算各組增重率；剖殺，取盲腸，參照文獻(xiàn)[10]介紹的5分制記分進(jìn)行盲腸病變記分并計(jì)算病變值，病變值以各組雞平均病變記分乘以10[11]。凡在試驗(yàn)中因球蟲死亡的雞，其腸道病變記分均為4分。

1.5.3 耐藥性判定方法及標(biāo)準(zhǔn)

1.5.3.1 抗球蟲指數(shù) （Anticoccidia indexes，ACI）=（相對(duì)增重率+存活率）-（病變值+卵囊值）；相對(duì)增重率=（感染用藥組平均增重率/不感染不用藥組平均增重率）×100%；存活率=（組內(nèi)存活數(shù)/組內(nèi)總雞數(shù)）×100%；病變值=各試驗(yàn)組的平均病變記分×10；ACI≥160，耐藥檢測結(jié)果為陰性（-）；ACI<160，耐藥檢測結(jié)果為陽性（+）。

1.5.3.2 病變記分減少率 （reduction of lesion scores，RLS）=[（感染不用藥組平均病變記分-感染用藥組平均病變記分）/感染不用藥組平均病變記分]×100%。RLS≤50%，耐藥檢測結(jié)果為陽性（+）；RLS>50%，耐藥檢測結(jié)果為陰性（-）。

1.5.3.3 相對(duì)卵囊產(chǎn)量 （relative oocysts production，ROP）=（感染用藥組平均卵囊數(shù)/感染不用藥組平均卵囊數(shù)）×100%。ROP<15%，耐藥檢測結(jié)果為陰性（-）；ROP≥15%，耐藥檢測結(jié)果為陽性（+）。

1.5.3.4 最適抗球蟲活性百分率（percent of optimum anticoccidial activity，POAA）=[（感染用藥組GSR-感染不用藥組GSR）/（不感染不用藥組GSR-感染不用藥組GSR）]×100%；GSR=籠末重/籠初重。

POAA≤50%，耐藥檢測結(jié)果為陽性（+）；POAA>50%，耐藥檢測結(jié)果為陰性（-）。

參照黃兵等[6]介紹的方法，以抗球蟲指數(shù)（ACI）、病變記分減少率（RLS）、相對(duì)卵囊產(chǎn)量（ROP）、最適抗球蟲活性百分率（POAA）4項(xiàng)指標(biāo)綜合判定蟲株對(duì)藥物的耐藥程度。4項(xiàng)指標(biāo)中，全部為陰性判定為不耐藥；1項(xiàng)為陽性判定為輕度耐藥；2項(xiàng)為陽性判定為中度耐藥；3～4項(xiàng)為陽性判定為完全耐藥。

2 結(jié)果

2.1 耐藥株的誘導(dǎo) 以15 mg/kg為起始誘導(dǎo)濃度，逐漸增加藥物濃度，每次傳代是用上一代所收集的卵囊供下一代接種繼續(xù)誘導(dǎo)，經(jīng)過10次傳代，獲得的蟲株接種雛雞，在飼喂60 mg/kg鹽霉素后第8 d發(fā)現(xiàn)，雞腸道病變嚴(yán)重，和感染對(duì)照組相比病變程度一致，初步認(rèn)為獲得了對(duì)60 mg/kg鹽霉素耐藥的耐藥株。具體傳代過程：2次傳代（15 mg/kg）→3次傳代（30 mg/kg）→2次傳代（45 mg/kg）→3次傳代（60 mg/kg）。

2.2 誘導(dǎo)蟲株的耐藥性檢測

2.2.1 ACI檢測 鹽霉素、甲基鹽霉素組的ACI分別為156.92、134.88，表現(xiàn)為耐藥；其他藥物的ACI值分別為191.5、195.99、186.19，表現(xiàn)為無耐藥性。具體結(jié)果見表1。

表1 各組雞的ACITable 1 ACI of each group of chickens

2.2.2 RLS檢測 地克珠利、癸氧喹酯、氯苯胍組試驗(yàn)雞的病變值較小，病理變化較輕；鹽霉素和甲基鹽霉素組試驗(yàn)雞的病變值相對(duì)較高，病理變化比較嚴(yán)重。以上各組RLS值都小于50%，呈陰性，表現(xiàn)為無耐藥性。具體結(jié)果見表2。

表2 各組雞的RLSTable 2 RLS of each group of chickens

2.2.3 ROP檢測 地克珠利、氯苯胍及癸氧喹酯組的ROP分別為14.43%、7.90%、14.74%，呈陰性，表現(xiàn)為無耐藥性；鹽霉素，甲基鹽霉素組的ROP分別為28.17%、84.4%，呈陽性，表現(xiàn)為耐藥。具體結(jié)果見表3。

表3 各組雞的ROPTable 3 ROP of each group of chickens

2.2.4 POAA檢測 地克珠利、癸氧喹酯、氯苯胍組的GSR值較高，其POAA分別為95.69%、98.85%、100.75%，呈陰性，表現(xiàn)為無耐藥性；鹽霉素和甲基鹽霉素組的GSR較高，其POAA分別為32.38%、30.05%，呈陽性，表現(xiàn)為耐藥。具體結(jié)果見表4。

表4 各組雞的POAATable 4 POAA of each group of chickens

2.2.5 各組雞的耐藥性綜合評(píng)價(jià) 根據(jù)4項(xiàng)指標(biāo)檢測結(jié)果綜合判定，試驗(yàn)蟲株對(duì)地克珠利、氯苯胍和癸氧喹酯無耐藥性；對(duì)鹽霉素和甲基鹽霉素的POAA、ACI、ROP均為陽性，表現(xiàn)為完全耐藥。結(jié)果見表5。

3 討論

鹽霉素是日本科研化學(xué)株式會(huì)社中央研究所于1968年從白色鏈霉菌ATCC21838菌株的培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)和提取的動(dòng)物專用抗生素，是一元羧酸聚醚類抗生素。聚醚類抗生素具有形成脂溶性絡(luò)合物的能力，這種絡(luò)合物為各種離子穿透脂類障礙（生物體膜）提供了運(yùn)載工具，根據(jù)這種承載陽離子的特性，稱這類化合物為離子載體類抗生素。鹽霉素尤其同K+、Na+、Rb+親合性特別高，用鼠肝線粒體進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果顯示，由于線粒體內(nèi)部的K+、Na+、Rb+有選擇地流出膜外，線粒體出現(xiàn)收縮現(xiàn)象[12]。目前，鹽霉素已在規(guī)?；B(yǎng)雞場廣泛使用，球蟲對(duì)其產(chǎn)生耐藥性已成必然趨勢。

自20世紀(jì)50年代以來，通過實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)球蟲對(duì)某種藥物產(chǎn)生耐藥性成為研究球蟲耐藥性產(chǎn)生機(jī)理的方法之一[13]。國內(nèi)也在實(shí)驗(yàn)室分別誘導(dǎo)了柔嫩艾美耳球蟲抗鹽霉素晚熟系[14]、地克珠利和馬杜拉霉素[15]等的耐藥株。韓紅玉等[15]通過藥物濃度遞增的方法，分別經(jīng)過18和20次傳代，成功地誘導(dǎo)了柔嫩艾美耳球蟲對(duì)地克珠利和馬杜拉霉素具有完全抵抗力的耐藥蟲株。潘虹等[16]經(jīng)過9次傳代，成功地誘導(dǎo)了柔嫩艾美耳球蟲對(duì)癸氧喹酯（decoquinate）具有完全抵抗力的耐藥蟲株。覃宗華等[17]用同樣的方法，分別經(jīng)過10次和12次傳代，在實(shí)驗(yàn)室條件下誘導(dǎo)獲得了對(duì)鹽酸氨丙啉（amprolium hydrochloride）和鹽酸氟乙基硫胺素（fluoroethylthiamine hydrochloride）產(chǎn)生耐藥性的柔嫩艾美耳球蟲蟲株。本實(shí)驗(yàn)也通過使用藥物濃度遞增的方法，經(jīng)過10次傳代，成功誘導(dǎo)出了柔嫩艾美耳球蟲對(duì)鹽霉素具有完全抵抗力的耐藥蟲株。

對(duì)于球蟲耐藥性的判定，不同的研究者所采用的標(biāo)準(zhǔn)和指標(biāo)都不盡相同?？追爆幍萚18]以RLS、ROP和POAA 3個(gè)指標(biāo)對(duì)國內(nèi)15個(gè)雞場的球蟲株進(jìn)行了抗藥性檢測。黃兵等[6]對(duì)上海地區(qū)雞球蟲抗藥性檢測時(shí)，除采用上述3個(gè)指標(biāo)外，還運(yùn)用了ACI進(jìn)行綜合判定。韓紅玉等[14]除了采用上述4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合判定外，還選擇GI（global resistance index），進(jìn)行對(duì)比，而GI指標(biāo)的準(zhǔn)確性、精確性尚有待于實(shí)踐的進(jìn)一步檢驗(yàn)。陳兆國等[19]對(duì)四項(xiàng)球蟲抗藥性判定指標(biāo)進(jìn)行了準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)，認(rèn)為在當(dāng)前條件下，用ACI、RLS、ROP、POAA四項(xiàng)指標(biāo)來綜合評(píng)定球蟲抗藥性的方法是有效的、可靠的。因此本實(shí)驗(yàn)采用ACI、POAA、RLS、ROP四項(xiàng)指標(biāo)對(duì)鹽霉素耐藥蟲株進(jìn)行綜合判定，雖然RLS呈陰性，但RLS的錯(cuò)判率和漏判率較高，相對(duì)準(zhǔn)確性稍差。因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以認(rèn)為我們成功獲得了對(duì)60 mg/kg鹽霉素完全耐藥的柔嫩艾美耳球蟲蟲株。

有報(bào)道球蟲對(duì)與同類抗球蟲藥物或作用機(jī)理相同的藥物容易產(chǎn)生一定程度的交叉耐藥性[20]。甲基鹽霉素與鹽霉素的差別在于多了一個(gè)甲基，其抗球蟲特性與鹽霉素相似。本研究結(jié)果顯示，誘導(dǎo)的柔嫩艾美耳球蟲鹽霉素耐藥株對(duì)甲基鹽霉素也完全耐藥，因此，我們推測球蟲對(duì)鹽霉素和甲基鹽霉素存在交叉耐藥性。