陸 艷，楊 義，張彥兵，魏建超，劉 珂，邵東華，李蓓蓓，馬志永，邱亞峰

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

Notch信號(hào)通路作為一種進(jìn)化過程中保守的信號(hào)通路，通過影響細(xì)胞的分化、增生、存活等在宿主發(fā)育中起著必要的作用[1]。在哺乳動(dòng)物中，Notch信號(hào)通路由4個(gè)受體（Notch1、Notch2、Notch3和Notch4）以及5個(gè)配體（Jagged1、Jagged2、Dll1、Dll3和Dll4）構(gòu)成。Notch信號(hào)通路為一種細(xì)胞間的信號(hào)通路，由不同細(xì)胞表面的受體和配體的相互作用而激活。具體為在配體與受體的細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合后，胞內(nèi)區(qū)（intracellular domain of Notch receptors,NICD）在蛋白酶（如γ-分泌酶）的作用下裂解，并釋放入細(xì)胞核中；其中，在經(jīng)典的Notch信號(hào)通路激活時(shí)，核內(nèi)NCID與Notch信號(hào)通路的調(diào)控因子RBP-J結(jié)合，并招募相關(guān)的共激活蛋白（如CBP/p300等）調(diào)控下游靶基因（如Hey1等）的轉(zhuǎn)錄[2]。

Notch信號(hào)通路在免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，包括T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的發(fā)育、T細(xì)胞功能調(diào)控、Th細(xì)胞的分化等。除淋巴細(xì)胞外，Notch信號(hào)通路影響DC細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用以及巨噬細(xì)胞的激活[3-8]。有研究顯示，TLR信號(hào)通路影響Notch信號(hào)通路中受體和配體的表達(dá)，繼而通過Notch信號(hào)通路調(diào)控炎性因子的分泌以及巨噬細(xì)胞的激活[9]。由此可知，Notch-TLR相互協(xié)作促進(jìn)TLR介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的激活以及炎性反應(yīng)。

在人和小鼠上，Notch信號(hào)通路協(xié)同TLR調(diào)控炎性反應(yīng)[3,10-11]。在豬源巨噬細(xì)胞上是否也存在Notch-TLR相互作用調(diào)控TLR誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，目前還不清楚。本研究利用LPS處理豬肺泡巨噬細(xì)胞，分析LPS處理對(duì)Notch信號(hào)通路配體、受體以及下游靶基因表達(dá)的影響。此外，利用Notch信號(hào)通路抑制劑以及RBP-J基因沉默研究Notch信號(hào)通路對(duì)LPS誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的調(diào)控作用。本研究結(jié)果將為Notch信號(hào)通路在豬相關(guān)疾病中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 OPTI-MEM、EDTA、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、細(xì)胞用PBS緩沖液均購自Gibco公司；抑制劑DAPT和LPS購自SIGMA公司；RNAiso PLUS（Trizol）、PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）均購自TaKaRa生物技術(shù)有限公司。Lipofectamine? RNAiMAX Reagent購自英濰捷基公司。

1.2 豬肺泡巨噬細(xì)胞的分離 實(shí)驗(yàn)用豬購自上海農(nóng)科院豬場(chǎng)；豬肺泡巨噬細(xì)胞取自35～40日齡的健康仔豬，健康豬安樂死后，取出肺臟，用PBS緩沖液清洗后移入超凈臺(tái)，利用PBS（含EDTA）進(jìn)行灌肺沖洗；4℃條件下將肺沖洗液300×g離心10 min，細(xì)胞利用RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸（含10%胎牛血清），計(jì)數(shù)后用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.3 DAPT抑制Notch信號(hào)通路 為了研究信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)中的作用，本實(shí)驗(yàn)選擇DAPT（γ-分泌酶抑制）處理PAM抑制Notch信號(hào)通路。將新鮮制備的PAM細(xì)胞接種于24孔板，每孔1×106個(gè)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后，加入DAPT（終濃度為20 μmol/L），DMSO處理組為對(duì)照，預(yù)處理1 h后，加入LPS（1 μg/mL）或DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后收樣。

1.4 RNA干擾 為了研究信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)中的作用，本研究采用RNA干擾沉默Notch信號(hào)通路調(diào)控因子RBP-J（siRNA序列見表1）抑制Notch信號(hào)通路的激活。按照上述的方法培養(yǎng)PAM，細(xì)胞貼壁后用1 μL RNAi MAX轉(zhuǎn)染總體積為1.5 μL濃度為20 μmol/L的siRNA，于轉(zhuǎn)染后66 h分別用LPS或DMSO處理，6 h后收樣。

1.5 熒光定量PCR 根據(jù)Trizol Reagent的說明書，提取細(xì)胞的總RNA，利用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，制備cDNA；隨后，根據(jù)TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ的說明書配制熒光定量混合物，利用ABI 7500進(jìn)行檢測(cè)。以GAPDH為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算percentage GAPDH的相對(duì)表達(dá)量（%GAPDH=100×2-ΔCT）以及差異倍數(shù)（Fold change=2-ΔΔCT）。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均使用t檢驗(yàn)進(jìn)行，P<0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用“*”表示；P<0.01為差異極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用“**”表示。

2 結(jié)果

2.1 在PAM上，LPS處理激活Notch信號(hào)通路 已有研究顯示，Notch信號(hào)通路參與調(diào)控LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)[12-13]，其主要是LPS處理影響了Notch信號(hào)通路中一些受體或配體的表達(dá)，繼而這些改變的受體或配體激活Notch信號(hào)通路，最終，影響炎性分子的表達(dá)。在PAM上，LPS處理是如何影響Notch信號(hào)通路中受體或配體表達(dá)的，還不清楚。因此，本研究首先在PAM上分析了LPS處理對(duì)Notch信號(hào)通路中受體或配體表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，LPS處理后在轉(zhuǎn)錄水平上顯著增加配體Jagged1、Jagged2和Dll4的表達(dá)（圖1A），但LPS處理不影響受體的表達(dá)（圖1B）。為了檢測(cè)LPS處理對(duì)Notch信號(hào)激活的影響，本研究對(duì)Notch信號(hào)通路的下游靶分子的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，LPS處理后在轉(zhuǎn)錄水平上顯著上調(diào)Notch信號(hào)通路下游靶基因Hey1的表達(dá)（圖1C）。以上結(jié)果說明，LPS處理通過增加配體的表達(dá)激活Notch信號(hào)通路。

圖1 Notch信號(hào)通路組分在豬肺泡巨噬細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of Notch signaling components in primary porcine alveolar macrophages

2.2 在PAM上，Notch信號(hào)通路抑制劑處理降低LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng) 在LPS處理激活Notch信號(hào)通路的研究基礎(chǔ)上，我們繼續(xù)分析了Notch信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)中的調(diào)控作用。首先，利用Notch信號(hào)通路的抑制劑DAPT（γ-分泌酶抑制劑）處理細(xì)胞，然后利用qPCR分析了炎性因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與DAPT未處理的對(duì)照組相比，DAPT顯著地降低LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α（圖2A）和IL-1β（圖2B）。此外，對(duì)Notch信號(hào)通路的下游靶基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)錄水平上DAPT處理抑制LPS誘導(dǎo)的Hey1的上調(diào)表達(dá)（圖2C）。以上結(jié)果說明，Notch信號(hào)通路參與調(diào)控LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)。

圖2 DAPT抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)并抑制靶基因表達(dá)Fig.2 DAPT attenuats LPS induced inflammatory responses and inhibits target gene expression

2.3 在PAM上，沉默Notch信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子RBP-J抑制LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng) 采用RNA干擾的方法沉默Notch信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子RBP-J分析Notch信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)中的作用。結(jié)果顯示，沉默RBP-J的表達(dá)（圖3A）顯著降低了LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α（圖3B）和IL-1β（圖3C）。此外，在轉(zhuǎn)錄水平上沉默RBP-J抑制LPS誘導(dǎo)的Hey1的上調(diào)表達(dá)（圖3D）。與DAPT處理的結(jié)果一致，Notch信號(hào)通路參與調(diào)控LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)。

圖3 干擾RBP-J可抑制LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)并抑制靶基因表達(dá)Fig. 3 Interference with RBP-J inhibits inflammatory responses induced by LPS and inhibits target gene expression

3 討論

本研究利用LPS/TLR4誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的模型初步揭示了在PAM上Notch-TLR通過協(xié)作調(diào)控促進(jìn)炎性反應(yīng)的機(jī)制，具體表現(xiàn)為：1）LPS/TLR4促進(jìn)Notch信號(hào)通路的激活，包括在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)Jagged1、Jagged2、Dll4和靶基因Hey1的表達(dá)；2）Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT抑制LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)；3）沉默Notch信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子RBP-J的表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果不僅揭示了在PAM上TLR促進(jìn)Notch信號(hào)通路的激活，而且激活的Notch信號(hào)通路可進(jìn)一步誘導(dǎo)TLR介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。

在人和小鼠巨噬細(xì)胞上的研究發(fā)現(xiàn)，LPS處理誘導(dǎo)不同Notch配體和受體的表達(dá)。在小鼠巨噬細(xì)胞上，LPS處理顯著上調(diào)Jagged1的表達(dá)，但對(duì)其他配體或受體表達(dá)的影響因細(xì)胞不同而有所變化[13]。在BMDM上，LPS處理上調(diào)Dll4，但在人巨噬細(xì)胞上，LPS處理上調(diào)Jagged1和Dll1的表達(dá)對(duì)Dll4的表達(dá)沒有影響[13]，而在RAW264.7細(xì)胞上，LPS處理并不影響Dll4的表達(dá)，反而促進(jìn)Notch1的上調(diào)表達(dá)[12]。本研究結(jié)果顯示，LPS處理增加了Jagged1、Jagged2和Dll4的上調(diào)表達(dá)，但不影響Notch受體的表達(dá)。因此，在不同的巨噬細(xì)胞上（人、小鼠和豬），LPS誘導(dǎo)都可上調(diào)Jagged1的表達(dá)，而其他配體或受體的變化因物種及細(xì)胞類型不同有所變化，Jagged1的上調(diào)表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)起著重要的作用[13-14]，但上調(diào)的Jagged1是否對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)起著重要的作用尚需進(jìn)一步研究。

與對(duì)人或小鼠巨噬細(xì)胞上的研究結(jié)果類似，在PAM上，DAPT處理抑制LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)。Notch信號(hào)通路存在經(jīng)典或非經(jīng)典的模式，本研究結(jié)果顯示，沉默RBP-J（經(jīng)典Notch信號(hào)通路調(diào)控因子）抑制LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)。由此可知，在PAM上，LPS/TLR4通過經(jīng)典的Notch通路調(diào)控炎性反應(yīng)。

在獸醫(yī)臨床上，由多種病原微生物導(dǎo)致的豬呼吸道綜合征（porcine respiratory disease complex,PRDC）給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失。其中，繼發(fā)的細(xì)菌感染是導(dǎo)致PRDC的關(guān)鍵因素，其主要是通過誘導(dǎo)炎性因子的表達(dá)促進(jìn)PRDC的產(chǎn)生[15-20]。本研究結(jié)果顯示，Notch信號(hào)通路調(diào)控LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，不僅為揭示PRDC（由繼發(fā)性細(xì)菌感染引起的）的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為將來PRDC疾病的防控提供重要的藥物靶標(biāo)。