姚曉慧，仝慧嫻，王舒豐，魏建超，劉 珂，邵東華，邱亞峰，馬志永，李蓓蓓，夏利寧

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊830052；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

腸球菌（Enterococcus）是革蘭氏陽性兼性厭氧菌，對(duì)多種抗生素具有天然耐藥和獲得性耐藥，是一種重要的人畜共患菌，是造成醫(yī)院內(nèi)感染的第二大病原菌[1-3]。近年來，隨著臨床抗菌藥物的廣泛使用，腸球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性和耐藥種類不斷增加，尤其是耐萬古霉素腸球菌（vancomycin resistant Enterococcus，VRE）和氨基糖苷類高水平耐藥腸球菌（high-level aminoglycoside resistant，HLAR）的出現(xiàn)，使得臨床治療的困難性進(jìn)一步加大[4]。2017年2月，世界衛(wèi)生組織將屎腸球菌列入重點(diǎn)病原體清單，以期在應(yīng)對(duì)腸球菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性時(shí)作出有效指導(dǎo)[5]。

養(yǎng)殖場(chǎng)的動(dòng)物源腸球菌耐藥菌株可通過食物鏈傳遞給人，其耐藥基因可在質(zhì)粒等移動(dòng)元件介導(dǎo)水平傳播給其他病原菌，給人類健康和公共衛(wèi)生帶來威脅[6]。本研究系統(tǒng)地對(duì)我國18個(gè)省市的豬源腸球菌進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)其耐藥性進(jìn)行調(diào)查分析，為腸球菌耐藥危害的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和動(dòng)物源耐藥性的防控提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

1. 材料與方法

1.1 菌株來源 2016年12月～2017年5月，自我國18個(gè)省市59個(gè)豬養(yǎng)殖場(chǎng)，用無菌拭子采集新鮮糞便，共836份樣品，采樣地點(diǎn)包括：新疆維吾爾自治區(qū)、青海省、四川省、貴州省、北京市、云南省、山西省、浙江省、遼寧省、福建省、海南省、黑龍江省、河北省、吉林省、江西省、山東省、河南省、上海市；標(biāo)準(zhǔn)菌株糞腸球菌ATCC29212、金黃色葡萄球菌ATCC29213均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 藥品與試劑 β-內(nèi)酰胺類：氨芐西林（ampicillin）（AM）；氨基糖苷類：阿米卡星（amikacin）（AMK）；喹諾酮類：環(huán)丙沙星（ciprofloxacin）（CIP）；酰胺醇類：氟苯尼考（florfenicol）（FFC）、氯霉素（chloramphenicol）（CHL）；大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素（erythromycin）（ERY）；四環(huán)素類：四環(huán)素（tetracycline）（TET）、米諾霉素（minomycin）（MI）、多西環(huán)素（doxycycline）（DOX）；惡唑烷酮類：利奈唑胺（linezolid）（LZD）；糖肽類：萬古霉素（vancomycin）（VAN）。以上抗菌藥物均購自上海源葉生物科技有限公司。

Mueller-Hinton肉湯、BHI肉湯、Mueller-Hinton瓊脂、腸球菌培養(yǎng)基（疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂）和檸檬酸鐵銨均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌瓊脂粉購自青島高科園海博生物有限公司；1×TE緩沖液購自生工生物工程（上海）有限公司；DL2000 DNA marker購自天根生化科技（北京）有限公司；2×Taq PCR Master Mix、瓊脂糖、50×TAE和核酸染料均購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.3 分離及初步鑒定 將采集的樣品置于1 mL 6.5%氯化鈉BHI肉湯中，42℃、200 rpm培養(yǎng)18～24 h，用無菌接種環(huán)劃線接種于腸球菌培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)18～24 h，選取平板表面呈白色圓滑、凸起、大小適中且菌落周圍顯黑色的單一菌落增菌后，制成20%甘油菌，-20℃保存?zhèn)溆肹7]。

1.4 基因組制備 將初步鑒定的腸球菌單菌落接種于1 mL BHI培養(yǎng)基中，37℃、200 rpm培養(yǎng)過夜，吸取200 μL菌液13 201×g離心1 min，棄上清液；加500 μL 1×TE緩沖液震蕩混勻，13 201×g離心1 min，棄上清液；加200 μL 1×TE緩沖液震蕩混勻，沸水煮2 min，冰浴2 min；17 968×g離心5 min，取上清液（60～80 μL即可）做DNA模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物合成 根據(jù)文獻(xiàn)[7]已有序列合成引物，對(duì)初步鑒定分離出的腸球菌擴(kuò)增屎腸球菌（E. faecium）、糞腸球菌（E. faecalis）、鶉雞腸球菌（E. gallinarum）及鉛黃腸球菌（E. casseliflavus）的持家基因。對(duì)未鑒定出的腸球菌用16S rRNA擴(kuò)增后送測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)以確定種屬。引物均由上海英俊生物有限公司合成，見表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.6 藥敏試驗(yàn) 按照CLSI[8]推薦的瓊脂稀釋法，對(duì)分離的腸球菌菌株進(jìn)行11種抗菌藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測(cè)定。以糞腸球菌ATCC29212和金黃色葡萄球菌ATCC29213作為質(zhì)控菌株。MIC結(jié)果均按照CLSI發(fā)布的M100-S26（2016）抗微生物抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。氟苯尼考因目前尚無腸球菌MIC值的判定標(biāo)準(zhǔn)，故采用CLSI[9]發(fā)布的VET01-A4中豬源鏈球菌氟苯尼考的判定標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果以敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）3種形式表示。

2 結(jié)果

2.1 豬源腸球菌分離結(jié)果 通過對(duì)初步鑒定分離出的腸球菌進(jìn)行屎腸球菌（E. faecium）、糞腸球菌（E.faecalis）、鶉雞腸球菌（E. gallinarum）的持家基因擴(kuò)增，電泳結(jié)果均與預(yù)期片段大小符合（圖1）。對(duì)未鑒定出的腸球菌用16S rRNA擴(kuò)增后送測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)以確定種屬。

圖1 腸球菌持家基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of Enterococcus housekeeping gene by PCR

836份樣品中共分離到225株腸球菌（表2），其中屎腸球菌106株，占腸球菌總數(shù)量的47.1%；糞腸球菌共56株，占腸球菌總數(shù)量的24.9%；小腸腸球菌共34株，占腸球菌總數(shù)量的15.1%；鶉雞腸球菌共17株，占腸球菌總數(shù)量的6.2%；鉛黃腸球菌7株，堅(jiān)忍腸球菌4株，Enterococcus thailandicus1株。

表2 我國18省市豬源腸球菌分離結(jié)果Table 2 The isolation of Enterococcus spp. of pig origin from 18 provinces in China

從我國不同省市豬源腸球菌的分離結(jié)果可知，分離率普遍不超過50%。腸球菌分離率由高到低的豬養(yǎng)殖場(chǎng)所在地依次為貴州省、青海省、云南省、上海市、河北省、江西省、北京市、新疆維吾爾自治區(qū)、山東省、福建省、四川省、吉林省、河南省、浙江省、海南省、遼寧省、黑龍江省、山西省，其中貴州省、四川省、福建省、河北省、上海市豬養(yǎng)殖場(chǎng)分離的腸球菌種類較多。

2.2 225株豬源腸球菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)分離出的豬源腸球菌進(jìn)行11種抗菌藥物的耐藥檢測(cè)（圖2），豬源腸球菌除對(duì)萬古霉素和利奈唑胺不耐藥外，對(duì)其他抗菌藥物均呈現(xiàn)不同程度的耐藥。豬源腸球菌對(duì)阿米卡星、氟苯尼考、紅霉素、四環(huán)素、米諾環(huán)素和多西環(huán)素的耐藥率分別是94.7%（213/225）、88.4%（199/225）、86.2%（194/225）、98.2%（221/225）、88.9%（200/225）、89.3%（201/225），6種抗菌藥物的耐藥率平均高達(dá)91%。對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率為63.1%（142/225），對(duì)氨芐西林的敏感率為66.2%（149/225），對(duì)利奈唑胺的中介率達(dá)54.7%（123/225），對(duì)萬古霉素高度敏感。由圖3可知，我國18個(gè)省市的豬源腸球菌多藥耐藥菌株主要集中在6耐、7耐和8耐，共占腸球菌總數(shù)的72.9%（164/225）。腸球菌在5耐及5耐以下的耐藥菌株共占腸球菌總數(shù)的15.5%（35/225），對(duì)9種抗菌藥物均耐藥的腸球菌菌株有26株，占腸球菌總數(shù)的11.6%。

圖2 豬源腸球菌對(duì)11種抗菌藥物的耐藥結(jié)果Fig.2 Resistance rates of 11 tested antibiotics for Enterococcus isolates of pig origin

圖3 豬源腸球菌多藥耐藥譜Fig.3 Multi-drug resistance patterns of Enterococcus isolates of pig origin

2.3 豬源不同腸球菌屬對(duì)11種抗菌藥物耐藥情況分析 整體來看，我國18個(gè)省市豬源不同腸球菌屬中的糞腸球菌（57株）、屎腸球菌（106株）、小腸腸球菌（34株）對(duì)除利奈唑胺和萬古霉素不耐藥外，對(duì)其余9種測(cè)試抗菌藥物均顯示不同程度的耐藥（圖4）。糞腸球菌、屎腸球菌、小腸腸球菌均對(duì)阿米卡星、氟苯尼考、紅霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素6種抗菌藥物的耐藥情況沒有明顯差異，耐藥率在80%以上。屎腸球菌對(duì)氨芐西林的耐藥率明顯高于其他兩種腸球菌的耐藥率，對(duì)環(huán)丙沙星耐藥率高于小腸腸球菌的耐藥率。糞腸球菌對(duì)氯霉素的耐藥率高于其他兩種腸球菌的耐藥率。

圖4 豬源不同腸球菌對(duì)11種抗菌藥物的耐藥結(jié)果Fig.4 Resistance of 11 tested antibiotics for di ff erent Enterococcus isolates of pig origin

3 討論

腸球菌與大腸桿菌都是人和家畜腸道常在菌，腸球菌的天然耐藥和易獲得性耐藥使其成為耐藥基因的儲(chǔ)存庫，是研究細(xì)菌耐藥的重要菌群[10-11]。

從本研究中豬源不同腸球菌屬分離結(jié)果可以看出，屎腸球菌的分離率最高；從不同省市豬養(yǎng)殖場(chǎng)分離的腸球菌結(jié)果來看，屎腸球菌的分離率也是較高的，這說明在被檢豬養(yǎng)殖場(chǎng)的腸球菌中主要分布的是屎腸球菌，其感染率較高，與劉曉薇等[12]的報(bào)道相符合。

本研究的藥敏結(jié)果表明，豬源腸球菌對(duì)檢測(cè)的11種抗菌藥物存在不同程度的耐藥。除萬古霉素和利奈唑胺外，對(duì)其余9種測(cè)試抗菌藥物均有不同程度的耐藥。其中，不同腸球菌屬對(duì)四環(huán)素類的3種抗菌藥物均有較高的耐藥率，高達(dá)80%以上，與幸文定[13]和吳帆等[14]報(bào)道的豬源腸球菌對(duì)四環(huán)素類抗菌藥物的耐藥結(jié)果相似。分析其原因可能是多年來由于四環(huán)素類的廣泛應(yīng)用，臨床常見革蘭陽性菌病原菌對(duì)四環(huán)素多數(shù)耐藥，并且，同類品種之間存在交叉耐藥。腸球菌對(duì)紅霉素抗菌藥物的耐藥率（86.2%）偏高，與陳麗穎等[15]報(bào)道的豬源腸球菌對(duì)紅霉素的耐藥率（84.62%）相近。

值得慶幸的是，本研究中未檢出對(duì)萬古霉素耐藥的菌株，但豬源腸球菌對(duì)萬古霉素的中介率為11.1%，養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)持續(xù)對(duì)萬古霉素的耐藥性進(jìn)行監(jiān)測(cè)并及時(shí)做出相應(yīng)措施。豬源腸球菌對(duì)氯霉素的耐藥率（29.8%）最低，這個(gè)結(jié)果可能與氯霉素被禁止用于食品動(dòng)物有關(guān)。值得注意的是，豬源腸球菌對(duì)利奈唑胺的中介率約達(dá)60%，利奈唑胺作為治療VRE和MRSA的最后一道防線，若不對(duì)使用劑量加以控制，可能會(huì)造成“無藥可用”的境地[15-16]。

多藥耐藥結(jié)果顯示，本研究中腸球菌的耐藥水平普遍較高，耐藥譜型較廣泛，最多可耐9種抗菌藥物，說明養(yǎng)殖場(chǎng)多局限于使用相對(duì)固定的幾種藥物，未能根據(jù)細(xì)菌的耐藥情況及時(shí)做出調(diào)整，長(zhǎng)期如此使用可導(dǎo)致多重耐藥菌株的產(chǎn)生。

綜上所述，我國18個(gè)省市豬養(yǎng)殖場(chǎng)分離的腸球菌對(duì)常見抗菌藥物耐藥率較高，耐藥率較高的幾類抗菌藥物分別是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類，其耐藥基因可傳播給人或其他動(dòng)物，造成人類健康和公共衛(wèi)生的潛在威脅。因此，腸球菌的耐藥調(diào)查應(yīng)引起更多關(guān)注，做好長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)工作，嚴(yán)格控制抗菌藥物的使用，以達(dá)到最好的治療效果和減少新的耐藥菌株的產(chǎn)生。