林江波，王偉英，鄒 暉，戴藝民

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，福建漳州 363005)

植物甾醇是一類甾體類植物天然活性物質(zhì)，具有延緩衰老[1]、抗氧化[2]和抗腫瘤[3]等功效。植物甾醇根據(jù)側(cè)鏈C-24位上烷基的有無分為無烷基甾醇、甲基甾醇和乙基甾醇，菜油甾醇和菜籽甾醇屬于甲基甾醇，豆甾醇和β-谷甾醇屬于乙基甾醇[4-5]。周海玥等[6]研究發(fā)現(xiàn)，豆甾醇和β-谷甾醇具有改善非酒精性脂肪肝肝細(xì)胞脂肪變性程度及減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用；張碩等[7]研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草豆甾醇具有抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的作用；周玲玉等[8]研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可以誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞G2/M期細(xì)胞周期阻滯，引起癌細(xì)胞凋亡。甾醇C-24甲基轉(zhuǎn)移酶2(SMT2)催化24-亞甲基膽甾烯醇合成24-亞乙基膽甾烯醇[9-10]，是乙基甾醇合成關(guān)鍵酶，開展SMT2基因功能研究對研究植物甾醇的代謝和調(diào)控具有重要意義。目前，已經(jīng)從多種植物中克隆到SMT2基因[11-13]，但是開展SMT2基因功能研究的還少有報(bào)道。

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)是蘭科(Orchidaceae)石斛屬(DendrobiumSw.)的名貴中藥材，位列“中華九大仙草”之首，其功效成分主要有多糖、石斛堿、黃酮和甾醇類等[14-18]，具有提高免疫力和抗腫瘤等生理活性[19-22]。本課題組基于對鐵皮石斛莖和葉的轉(zhuǎn)錄組測序，分析了鐵皮石斛植物甾醇的代謝途徑，分3個(gè)階段，50個(gè)unigenes (30種酶)參與，鐵皮石斛甾醇C-24甲基轉(zhuǎn)移酶2基因(DoSMT2)在葉的表達(dá)量高于莖，生長期高于成熟期[23]；克隆了鐵皮石斛DoSMT2基因的全長cDNA序列，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明DoSMT2蛋白屬于AdoMet-MTases超級(jí)家族，含有4個(gè)S-腺苷蛋氨酸結(jié)合位點(diǎn)、1個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶保守結(jié)構(gòu)域和1個(gè)甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶C末端保守結(jié)構(gòu)域，與深圳擬蘭(Apostasiashenzhenica)的SMT2親緣關(guān)系最近[24]。本研究構(gòu)建了DoSMT2基因正義植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化煙草，分析DoSMT2基因功能，以期為進(jìn)一步了解鐵皮石斛植物甾醇代謝機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

大腸桿菌(Esherichiacoli) DH5α菌株、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) EHA105菌株、PcxSN植物表達(dá)載體和煙草(Nicotianatabacum)NC89無菌試管苗由本實(shí)驗(yàn)室保存。

XcmⅠ購自NEB公司，2×Accurate TaqMaster Mix (dye plus)、SteadyPure植物RNA提取試劑盒和SYBR GreenProTaqHS 預(yù)混型qPCR試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；DNA Ligation Kit Ver.2.1和PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶購自寶生物工程(大連)有限公司；頭孢噻肟鈉(cefotaxime sodium)、特泯菌(timentin)、乙酰丁香酮(acetosyringone)、潮霉素 B 溶液(hygromycin B solution)、DNA膠回收試劑盒、UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。菜油甾醇(Lot B0408AS)和谷甾醇(Lot N0615AS)標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1DoSMT2基因開放閱讀框的克隆以重組的克隆載體質(zhì)粒pMD19-T-DoSMT2[24]為模板，利用引物SMT-F和SMT-R(表1)擴(kuò)增DoSMT2基因的開放閱讀框。PCR擴(kuò)增體系50 μL：質(zhì)粒pMD19-T-DoSMT2 1 μL，引物(10 mmol·L-1)各1 μL，2×Accurate TaqMaster Mix 25 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，膠回收目的片段。

1.2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建植物表達(dá)載體pCXSN經(jīng)XcmⅠ酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，膠回收載體片段?；厥债a(chǎn)物與DoSMT2基因的膠回收產(chǎn)物在16 ℃連接2 h，連接體系10 μL：pCXSN酶切回收產(chǎn)物2 μL、DoSMT2基因膠回收產(chǎn)物3 μL、Solution I 5 μL。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸肝菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，在105 r·min-1、37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)1 h后，菌液涂布于含卡那霉素100 mg·L-1的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單克隆在含卡那霉素100 mg·L-1的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃條件下200 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜。提取經(jīng)PCR鑒定為陽性克隆的質(zhì)粒，委托生工生物工程(上海)有限公司測序，通過序列比對獲得重組的正義植物表達(dá)載體質(zhì)粒pCXSN-DoSMT2(圖1)。

圖1 植物表達(dá)載體pCXSN-DoSMT2的構(gòu)建Fig.1 Construction of plant expression vector pCXSN-DoSMT2

1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)重組質(zhì)粒pCXSN-DoSMT2遺傳轉(zhuǎn)化煙草采用“凍融法”將重組正義植物表達(dá)載體質(zhì)粒pCXSN-DoSMT2導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉盤轉(zhuǎn)化法[25]，將pCXSN-DoSMT2基因遺傳轉(zhuǎn)化煙草，獲得抗潮霉素的抗性轉(zhuǎn)化植株。煙草轉(zhuǎn)化植株種植于溫室大棚。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測以CTAB法提取的煙草抗性轉(zhuǎn)化植株葉片基因組DNA為模板，用引物Hpt1和Hpt2進(jìn)行PCR擴(kuò)增潮霉素基因片段，篩選抗性轉(zhuǎn)化植株，產(chǎn)物長度為517 bp。用引物SMTBolt-F和SMTBolt-R進(jìn)行 PCR法制備地高辛標(biāo)記探針，經(jīng)PCR檢測為陽性的煙草植株基因組DNA用Hind Ⅲ酶切后用于Southern blot。Southern blot委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

用SteadyPure植物RNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)DoSMT2基因煙草葉片總RNA，用PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第1鏈。將合成的cDNA第1鏈濃度定量為200 ng·μL-1，以煙草Actin基因作為內(nèi)參基因，根據(jù)SYBR GreenProTaqHS 預(yù)混型qPCR試劑盒的說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增(Roche LightCycler 96)，檢測外源DoSMT2基因在不同轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)情況。DoSMT2基因引物為SMT2-F和SMT2-R，煙草Actin基因引物為NtACT-F和NtACT-R。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因煙草植物甾醇含量測定轉(zhuǎn)基因煙草葉片菜油甾醇和谷甾醇的含量委托青島科創(chuàng)質(zhì)量檢測有限公司測定，參考李濤等[26]的方法。

1)樣品前處理 取0.5 g轉(zhuǎn)基因煙草葉片粉末，于取樣瓶中，以非轉(zhuǎn)基因煙草葉片為對照，加入5 mL二氯甲烷，超聲波萃取20 min，6 000 r·min-1離心5 min，分離取出二氯甲烷，再加入5 mL二氯甲烷超聲波萃取10 min，離心分離取出二氯甲烷，合并2次萃取液，用二氯甲烷定容至10 mL，過0.45 μm濾膜后，進(jìn)樣分析。

2)色譜條件 Thermo TG-5 MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣量2 μL；升溫程序：80 ℃保持2 min，以20 ℃·min-1的速率升溫至300 ℃，保持15 min；進(jìn)樣口溫度為300 ℃；載氣為He，載氣流速為0.8 mL·min-1；分流比為40∶1。

3)質(zhì)譜條件 離子源溫度200 ℃，傳輸線溫度250 ℃，溶劑延遲時(shí)間3.00 min，掃描范圍30～450 m/z，離子源為EI源70 eV。

1.3 數(shù)據(jù)處理

方差分析采用DPS軟件[27]，差異顯著性用最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行平均數(shù)的多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 DoSMT2基因開放閱讀框克隆

以重組克隆載體質(zhì)粒pMD19-T-DoSMT2為模板，利用引物SMT-F和SMT-R擴(kuò)增DoSMT2基因的開放閱讀框，擴(kuò)增產(chǎn)物在1 119 bp處有1條特異性條帶(圖2)，膠回收目的條帶，獲得DoSMT2基因的開放閱讀框。

2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

膠回收XcmⅠ酶切后植物表達(dá)載體pCXSN片段，與DoSMT2基因膠回收產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆于含有100 mg·L-1卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基擴(kuò)繁，經(jīng)菌液PCR鑒定(圖3)后，提取陽性克隆菌株的質(zhì)粒并進(jìn)行測序，通過序列比對分析，獲得正義植物表達(dá)載體質(zhì)粒pCXSN-DoSMT2。

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA的PCR檢測

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉盤轉(zhuǎn)化法將重組正義植物表達(dá)載體pCXSN-DoSMT2遺傳轉(zhuǎn)化煙草，通過潮霉素抗性篩選，共獲得6株抗潮霉素?zé)煵葜仓?。提?株抗潮霉素?zé)煵葜仓昊蚪MDNA，以Hpt1和Hpt2作為引物，PCR擴(kuò)增潮霉素基因片段。其中4株能擴(kuò)增到1條517 bp特異條帶(圖4)，分別用代號(hào)P1、P2、P3和P4表示。以4株能擴(kuò)增到潮霉素基因片段的煙草植株基因組DNA為模板，以SMT-F和SMT-R為引物，擴(kuò)增DoSMT2基因，4株轉(zhuǎn)基因煙草植株在1 119 bp處能擴(kuò)增出1條特異條帶(圖5)，而非轉(zhuǎn)基因植株沒有該條帶，說明外源DoSMT2基因已經(jīng)整合到煙草基因組中。

M.DL2000;1-2.DoSMT2圖2 DoSMT2基因開放閱讀框PCR產(chǎn)物電泳Fig.2 PCR product electrophoresis of DoSMT2 gene ORF

M.DL2000;1、3、4.DoSMT2;2、5.陰性克隆圖3 重組質(zhì)粒pCXSN-DoSMT2的PCR檢測M.DL2000;1,3,4.DoSMT2;2,5.Negative cloneFig.3 PCR detection of recombinant plasmid pCXSN-DoSMT2

2.4 轉(zhuǎn)DoSMT2基因煙草基因組DNA的Southern blot檢測

經(jīng)過潮霉素基因和DoSMT2基因的PCR檢測為陽性的4株轉(zhuǎn)基因煙草植株和非轉(zhuǎn)基因煙草植株的基因組DNA用Hind Ⅲ酶切，以DIG標(biāo)記的DoSMT2基因?yàn)樘结樳M(jìn)行Southern雜交，以pMD19-T-DoSMT2為陽性對照。結(jié)果表明，4株轉(zhuǎn)基因煙草植株都有1條雜交信號(hào)帶，非轉(zhuǎn)基因煙草植株沒有雜交信號(hào)帶(圖6)，說明外源DoSMT2基因都以單拷貝整合到4株轉(zhuǎn)基因煙草基因組中。

M.DL2000;1-6.潮霉素抗性植株圖4 潮霉素基因片段的PCR檢測M.DL2000;1-6.Hygromycin resistant plantletFig.4 PCR detection of hygromycin gene fragment

M.DL2000;P1-P4.潮霉素抗性植株;CK-.非轉(zhuǎn)基因植株;CK+.pMD19-T-DoSMT2圖5 DoSMT2基因的PCR檢測M.DL2000;P1-P4.Hygromycin resistant tobacco;CK-.Non-transgenic tobacco;CK+.pMD19-T-DoSMT2Fig.5 PCR detection of DoSMT2 gene

M.DNA 分子量標(biāo)記Ⅱ;P1-P4.轉(zhuǎn)基因煙草植株;CK-.非轉(zhuǎn)基因煙草植株;CK+.pMD19-T-DoSMT2圖6 轉(zhuǎn)DoSMT2基因煙草植株的Southern blot雜交結(jié)果M.DNA molecular-weight marker Ⅱ;P1-P4.Transgenic tobacco;CK-.Non-transgenic tobacco;CK+.pMD19-T-DoSMT2Fig.6 Southern blot of transgenic tobacco with DoSMT2 gene

CK.非轉(zhuǎn)基因煙草;P1-P4.轉(zhuǎn)基因煙草;柱上不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同圖7 DoSMT2基因在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的表達(dá)分析CK.Non-transgenic tobacco;P1-P4.Transgenic tobacco;Different capital letters upon column indicate significant difference at 0.01 level.The same as belowFig.7 Expression of DoSMT2 gene in leaves of transgenic tobacco

2.5 轉(zhuǎn)基因煙草DoSMT2基因表達(dá)分析

以煙草Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，利用qRT-PCR技術(shù)檢測DoSMT2基因在4株轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的表達(dá)情況。結(jié)果表明(圖7)，非轉(zhuǎn)基因煙草未檢測到外源DoSMT2基因表達(dá)，4株轉(zhuǎn)基因煙草都能檢測到DoSMT2基因的表達(dá)，表達(dá)水平差異達(dá)到極顯著。其中表達(dá)量最高的是P3株，其次是P1株，P2和P4株的表達(dá)差異不顯著。

2.6 轉(zhuǎn)基因煙草葉片菜油甾醇和谷甾醇含量測定

對4株轉(zhuǎn)DoSMT2基因煙草葉片菜油甾醇和谷甾醇的含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明(圖8)，4株轉(zhuǎn)DoSMT2基因煙草葉片的菜油甾醇含量極顯著低于非轉(zhuǎn)基因煙草葉片，其中P1、P3和P4之間差異不顯著，但極顯著低于P2；4株轉(zhuǎn)DoSMT2基因煙草葉片的谷甾醇的含量都極顯著高于非轉(zhuǎn)基因煙草葉片，且4株之間也都存在極顯著差異，含量從高到低依次為P3>P1>P4>P2。

圖8 轉(zhuǎn)基因煙草葉片菜油甾醇和谷甾醇含量Fig.8 Contents of campesterol and sitosterol in transgenic tobacco leaves

3 討 論

植物甾醇是生物膜的組成成分，具有調(diào)節(jié)膜流動(dòng)性和滲透性的作用。甾醇C-24甲基轉(zhuǎn)移酶(sterol C-24-methyltransferase;SMT)分為SMT1和SMT2兩個(gè)家族。SMT1催化C-24位的第一次甲基化，完成甲基從S-腺苷甲硫氨酸到環(huán)阿屯醇的轉(zhuǎn)移，形成C-24甲烯基環(huán)阿屯醇，SMT2催化C-24位的第二次甲基化，形成24-亞乙基膽甾烯醇[28]。

SMT2位于植物甾醇合成途徑中甲基甾醇和乙基甾醇的一個(gè)分支點(diǎn)。已有研究結(jié)果表明，以CaMV 35S或TET1作為組成型啟動(dòng)子，利用根癌農(nóng)桿菌把擬南芥SMT2基因轉(zhuǎn)化煙草，對轉(zhuǎn)基因煙草葉片甾醇測定發(fā)現(xiàn)，菜油甾醇的含量下降，同時(shí)谷甾醇的含量增加，其他甲基甾醇、乙基甾醇和總甾醇含量與對照差異不大，說明SMT2基因主要調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中甲基甾醇菜油甾醇和乙基甾醇谷甾醇的含量和比例，不改變植物細(xì)胞中總甾醇的含量[29-31]。因此，通過檢測轉(zhuǎn)基因植株中菜油甾醇和谷甾醇含量的變化，可以驗(yàn)證SMT2基因的功能。本研究以CaMV 35S作為組成型啟動(dòng)子，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，把DoSMT2基因遺傳轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)過基因組水平檢測，獲得了4株在組成型啟動(dòng)子CaMV 35S控制下的轉(zhuǎn)DoSMT2基因煙草植株。qRT-PCR技術(shù)檢測表明，DoSMT2基因在4株轉(zhuǎn)基因煙草葉片中都有表達(dá)，且表達(dá)量存在極顯著的差異。通過分析轉(zhuǎn)基因煙草葉片菜油甾醇和谷甾醇的含量發(fā)現(xiàn)，DoSMT2基因在煙草葉片中的表達(dá)量與菜油甾醇含量呈負(fù)相關(guān)，與谷甾醇含量呈正相關(guān)。轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片菜油甾醇含量是非轉(zhuǎn)基因煙草的0.62～0.79倍，極顯著降低，谷甾醇含量是非轉(zhuǎn)基因煙草的1.54～2.22倍，極顯著升高。

綜上所述，DoSMT2具有催化24-亞甲基膽甾烯醇合成24-亞乙基膽甾烯醇的酶活性。本研究結(jié)果為后續(xù)調(diào)控鐵皮石斛植物甾醇生物合成及開發(fā)利用鐵皮石斛葉片植物甾醇打下了基礎(chǔ)。