吳珍 魏瑤 楊玉姣 徐貴濤 謝穎 胡旭光

中圖分類號 R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）09-1057-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.09.06

摘 要 目的：研究23-乙酰澤瀉醇B對肥胖模型小鼠糖脂代謝紊亂的改善作用及機(jī)制。方法：小鼠給予高脂飼料10周以復(fù)制肥胖模型。將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組、奧利司他組（陽性對照，15.6 mg/kg）和23-乙酰澤瀉醇B低、中、高劑量組（7.5、15、30 mg/kg），每組10只;另設(shè)置喂養(yǎng)普通飼料的小鼠10只為正常組。正常組和模型組小鼠灌胃水，給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，灌胃體積均為20 mL/kg，每天1次，連續(xù)4周。末次給藥后，測定小鼠的體質(zhì)量、腰圍和全身脂肪、肌肉和體液質(zhì)量;測定小鼠血清中血脂指標(biāo)[總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）]和血糖水平;采用酶聯(lián)免疫吸附法測定肝組織中過氧化物酶體增殖劑激活受體γ（PPAR-γ）、核因子κB（NF-κB）、白細(xì)胞介素6（IL-6）水平和血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平;采用蘇木精-伊紅染色法觀察小鼠脂肪和肝組織的病理變化。結(jié)果：與正常組比較，模型組小鼠體質(zhì)量、腰圍、全身脂肪和體液質(zhì)量均顯著增加（P<0.01）;血清中TC、TG、HDL-C、血糖、TNF-α水平和肝組織中PPAR-γ、NF-κB、IL-6水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;脂肪細(xì)胞結(jié)構(gòu)破裂、體積增大，伴有炎性細(xì)胞浸潤;大量肝細(xì)胞水腫，細(xì)胞漿疏松淡染，伴有脂肪變性。與模型組比較，23-乙酰澤瀉醇B各劑量組小鼠體質(zhì)量、全身脂肪和體液質(zhì)量以及血清中TG、TNF-α水平均顯著降低（P<0.01）;23-乙酰澤瀉醇B中、高劑量組小鼠血清中TC、血糖和肝組織中IL-6均顯著降低（P<0.05或P<0.01），肝組織中PPAR-γ水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;23-乙酰澤瀉醇B高劑量組小鼠腰圍和肝組織中NF-κB顯著減少或降低（P<0.01）;23-乙酰澤瀉醇B中劑量組小鼠血清中HDL-C水平顯著降低（P<0.01）;脂肪細(xì)胞排列緊密、體積較小;肝細(xì)胞輕中度腫脹，少量細(xì)胞漿疏松淡染或呈空泡狀，少量肝細(xì)胞伴脂肪變性和炎性細(xì)胞小灶性浸潤。結(jié)論：23-乙酰澤瀉醇B可改善肥胖模型小鼠的糖脂代謝紊亂，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)肝組織中PPAR-γ、NF-κB、IL-6水平和血清中TNF-α水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞 23-乙酰澤瀉醇B;肥胖;糖脂代謝紊亂;小鼠

Improvement Effects of Alisol B 23-acetate on Glycolipid Metabolism Disorder in Obesity Model Mice

WU Zhen，WEI Yao，YANG Yujiao，XU Guitao，XIE Ying，HU Xuguang（School of TCM， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects and its mechanism of alisol B 23-acetate on glycolipid metabolism disorder in obesity model mice. METHODS： The mice was given high-fat diet for 10 weeks to induce obesity model. Model mice were randomly divided into model group， orlistat group （positive control， 15.6 mg/kg）， alisol B 23-acetate low-dose， medium-dose and high-dose groups （7.5， 15， 30 mg/kg）， with 10 mice in each group. Another 10 mice fed with normal diet were set as normal group. The mice in normal group and model group were given water intragastrically， and administration groups were given the corresponding drugs intragastrically， with the volume of 20 mL/kg， once a day， for consecutive 4 weeks. After last medication， body weight， waist circumference， body fat， muscle and body fluid mass were measured; the serum levels of blood lipids indicators （TC， TG， HDL-C， LDL-C） and blood glucose were determined. The levels of PPAR-γ， NF-κB and IL-6 in liver tissue as well as serum level of TNF-α were determined by ELISA. The pathomorphological changes of visceral fat and liver tissue in mice were observed by HE staining. RESULTS： Compared with normal group， body weight， waist circumference， body fat and body fluid mass were significantly increased in model group （P<0.01）; serum levels of TC， TG， HDL-C， blood glucose and TNF-α， the levels of PPAR-γ， NF-κB and IL-6 in liver tissue were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）; the structure of adipocytes was ruptured， the volume of adipocytes was increased， accompanied by inflammatory cell infiltration; a large number of liver cells were edema， and cytoplasm was loose and light stained， accompanied by fatty degeneration. Compared with model group， the body weight， body fat and body fluid mass as well as serum levels of TG and TNF-α in alisol B 23-acetate groups were significantly reduced （P<0.01）; the levels of TC and blood glucose in serum， IL-6 in liver tissue were significantly decreased in alisol B 23-acetate medium-dose and high-dose groups （P<0.05 or P<0.01）， and the level of PPAR-γ in liver tissue was increased significantly （P<0.05 or P<0.01）; the waist circumference and NF-κB levels in liver tissue in alisol B 23-acetate high-dose group were decreased significantly （P<0.01）; serum level of HDL-C in alisol B 23-acetate medium-dose group were decreased significantly （P<0.01）; the adipocytes were closely arranged and small in size; the hepatocytes were mild to moderate swelling， a small amount of cytoplasm was loose， light stained or vacuolated， and a small number of hepatocytes were accompanied by steatosis and small focal infiltration of inflammatory cells. CONCLUSIONS： Alisol B 23-acetate can improve the disorder of glucose and lipid metabolism in obesity model mice， and its mechanism may be related to the regulation of PPAR-γ， NF-κB， IL-6 levels in liver tissue and TNF-α levels in serum.

KEYWORDS? ?Alisol B 23-acetate; Obesity; Glucose and lipid metabolism disorder; Mice

肥胖是一種現(xiàn)代流行病，常誘發(fā)糖尿病、高血壓、腦卒中等心腦血管疾病，給人們的健康造成各種潛在的危害[1-2]。目前，奧利司他是用于治療肥胖的主要藥物[3]，但其可導(dǎo)致脂肪/油糞便，增加大便次數(shù)，具有悶油、稀大便、腹痛、排便急促、胃脹氣、尿便失禁等副作用[4-7]。因此，開發(fā)新的改善肥胖的藥物，對于肥胖的治療具有重要意義。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）是脂肪形成的重要調(diào)節(jié)因子，在抑制炎癥因子生成過程、控制脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝方面具有重要作用[8-10]。核因子κB（NF-κB）可以增加脂肪細(xì)胞合成和分泌趨化因子，NF-κB信號通路的激活能促使腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素6（IL-6）等炎癥因子的大量釋放，導(dǎo)致機(jī)體組織炎癥反應(yīng)加劇，進(jìn)而促進(jìn)肥胖的進(jìn)展[11]。

澤瀉為澤瀉科植物澤瀉Alismaorientale （Sam.） Juzep.的干燥塊莖，其性寒，味甘、淡，歸腎、膀胱經(jīng)，具有利水滲濕、泄熱、化濁降脂的功效，主要用于治療小便不通、水腫脹滿、泄瀉尿少、痰飲眩暈、熱淋澀痛、高血脂等[12]。澤瀉中的主要化學(xué)成分是三萜類，其中23-乙酰澤瀉醇B含量較高[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，23-乙酰澤瀉醇B能降低肥胖模型小鼠血清中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）水平和減少肝組織中脂質(zhì)的積聚[14]?；诖?，本研究以高脂飼料喂養(yǎng)小鼠以復(fù)制肥胖模型，從小鼠體質(zhì)量、脂肪分布、血脂、血糖、肥胖調(diào)控因子（PPAR-γ、NF-κB）、炎癥因子（TNF-α、IL-6）角度，研究23-乙酰澤瀉醇B對模型小鼠糖脂代謝紊亂的改善作用，以期進(jìn)一步明確其改善肥胖的作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：LF9011型小動物核磁共振全身成分分析儀（美國Bruker公司）、TCL-16M型臺式高速冷凍離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、AUW120D型萬分之一電子天平（島津企業(yè)管理中國有限公司）、AJC-0501-P型超純水儀（重慶艾科浦有限公司）、TBA-120FR型全自動生化分析儀（日本Toshiba公司）、MK3型全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scienti- fic公司）、Eclipse Ci-L型顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有：23-乙酰澤瀉醇B（上海源葉生物科技有限公司，批號B21641，純度>98%），奧利司他膠囊（重慶華森制藥股份有限公司，批號180401，規(guī)格0.12 g），0.5%羧甲基纖維素鈉溶液（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號J1204A），血清TC、TG、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20200612、20200619、20190407、20200703），血糖檢測試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，批號20191207137），BCA蛋白濃度測定試劑盒、蘇木素-伊紅染色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號分別為P0012、C0105），小鼠TNF-α、IL-6、PPAR-γ、NF-κB酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號分別為MM-0517M1、MM-0163M1、MM-44573M1、MM-44802M1）;其余試劑均為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 動物與飼料

本研究所用動物為SPF級雄性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量20～25 g，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2018-0034。小鼠于廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為25 ℃，相對濕度為40%～60%，飼養(yǎng)期間自由攝食飲水。所用飼料包括高脂飼料（戴茨生物科技有限公司，批號20200722）、普通飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司，批號20113211）。本實(shí)驗(yàn)由廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為gdpulacspf2017281。

2 方法

2.1 肥胖模型小鼠的制備

80只小鼠采用普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)5天后隨機(jī)分為普通組（n=12）和造模組（n=68）。普通組小鼠繼續(xù)給予普通飼料，造模組小鼠則給予高脂飼料，均正常飲水。各組小鼠每周測定1次體質(zhì)量，10周后，測定小鼠體質(zhì)量和血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、血糖水平。當(dāng)造模組小鼠的體質(zhì)量超過普通組小鼠的30%，且血清中TC、TG、LDL-C、血糖水平均顯著高于普通組時，則表明小鼠肥胖模型制備成功[15-16]。

2.2 分組與給藥

從“2.1”項(xiàng)下普通組小鼠中隨機(jī)挑選10只作為正常組;從“2.1”項(xiàng)下造模組小鼠中隨機(jī)挑選50只，分為模型組、奧利司他組（陽性對照，15.6 mg/kg，劑量根據(jù)臨床等效劑量換算而得）和23-乙酰澤瀉醇B低、中、高劑量組（7.5、15、30 mg/kg，劑量根據(jù)文獻(xiàn)[17]設(shè)置），每組10只。正常組和模型組小鼠灌胃水，各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物（臨用時均以0.5%的羧甲基纖維素鈉溶解），灌胃體積均為20 mL/kg，每天1次，連續(xù)4周。

2.3 小鼠體質(zhì)量及腰圍測定

各組小鼠從開始給藥后，于每周二上午9：00定時測定其體質(zhì)量和腰圍（即用卷尺測定小鼠腹部經(jīng)過劍突與后肢間垂直距離中點(diǎn)一周的長度）。

2.4 小鼠全身脂肪、肌肉及體液質(zhì)量的測定

末次給藥后，將各組小鼠放入小動物核磁共振全身成分分析儀中并固定，掃描分析小鼠脂肪、肌肉和體液質(zhì)量。

2.5 取材及處理

末次給藥后，各組小鼠禁食不禁水18 h，然后眼眶靜脈竇取血。血樣室溫放置1.5 h后，于4 ℃條件下以? ?3 500 r/min離心10 min，取上清液，作為血清樣本。取血后，各組小鼠立即處死，剖取脂肪組織和肝臟。

2.6 小鼠血清中血脂指標(biāo)和血糖水平的檢測

取“2.5”項(xiàng)下各組小鼠血清樣本，采用全自動生化分析儀檢測血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C和血糖水平。

2.7 小鼠肝組織中PPAR-γ、NF-κB、IL-6和血清中TNF-α水平的檢測

取“2.5”項(xiàng)下各組小鼠肝組織適量，加入預(yù)冷RIPA裂解液，充分混勻，裂解20 min后，研磨成組織勻漿，于4 ℃條件下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，作為肝組織樣品。取肝組織樣品和“2.5”項(xiàng)下血清樣本，嚴(yán)格按照相應(yīng)ELISA試劑盒說明書方法操作，測定肝組織中PPAR-γ、NF-κB、IL-6和血清中TNF-α的水平。

2.8 小鼠脂肪和肝組織的病理形態(tài)學(xué)觀察

取“2.5”項(xiàng)下各組小鼠的脂肪和肝組織樣品適量，以4%多聚甲醛固定24 h，經(jīng)修剪、乙醇脫水、石蠟包埋、切片（厚度為5 μm）、梯度復(fù)水后，以蘇木精-伊紅染液染色5 min;在自來水中洗滌10 min后，以超純水洗滌1次;95%乙醇脫水2 min，以超純水洗滌2次;二甲苯透明5 min，以超純水洗滌2次;以中性樹膠封片，并于顯微鏡下觀察小鼠脂肪和肝組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠體質(zhì)量及腰圍的測定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠體質(zhì)量和腰圍均顯著增加（P<0.01）;與模型組比較，奧利司他組和23-乙酰澤瀉醇B各劑量組小鼠體質(zhì)量均顯著降低（P<0.01），奧利司他組和23-乙酰澤瀉醇B高劑量組小鼠腰圍顯著減少（P<0.01），詳見表1。

3.2 小鼠全身脂肪、肌肉和體液質(zhì)量的測定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠脂肪和體液質(zhì)量均顯著增加（P<0.01）;與模型組比較，奧利司他組和23-乙酰澤瀉醇B各劑量組小鼠脂肪和體液質(zhì)量均顯著減少（P<0.01），詳見表2。

3.3 小鼠血清中血脂指標(biāo)和血糖水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C和血糖水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，奧利司他組上述5個指標(biāo)水平和23-乙酰澤瀉醇B各劑量組血清中TG水平以及中、高劑量組TC和血糖水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），23-乙酰澤瀉醇B中劑量組HDL-C水平顯著降低（P<0.01），詳見表3。

3.4 小鼠肝組織中PPAR-γ、NF-κB、IL-6和血清中TNF-α水平的測定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠肝組織中PPAR-γ、NF-? κB、IL-6和血清中TNF-α水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，奧利司他組小鼠肝組織中上述3個指標(biāo)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;23-乙酰澤瀉醇B中、高劑量組小鼠肝組織中PPAR-γ水平均顯著升高、IL-6水平均顯著降低（P<0.01），高劑量組的NF-κB水平顯著降低（P<0.01）;23-乙酰澤瀉醇B各劑量組小鼠血清中TNF-α水平顯著降低（P<0.01），詳見表4。

3.5 小鼠脂肪和肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

正常組小鼠脂肪組織細(xì)胞體積較小，排列緊密;肝組織中肝索結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列緊密。模型組小鼠脂肪組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)破裂、體積增大，伴有炎性細(xì)胞浸潤;肝組織中可見大量肝細(xì)胞水腫，細(xì)胞漿疏松淡染，伴有脂肪變性。奧利司他組和23-乙酰澤瀉醇B中、高劑量組小鼠脂肪組織細(xì)胞排列緊密、體積較小，肝組織中可見肝細(xì)胞輕中度腫脹、少量細(xì)胞漿疏松淡染或呈空泡狀、少量肝細(xì)胞伴脂肪變性和炎性細(xì)胞小灶性浸潤; 23-乙酰澤瀉醇B低劑量組小鼠脂肪組織和肝組織與模型組比較差異不明顯，詳見圖1、圖2。

4 討論

隨著人們生活水平和飲食結(jié)構(gòu)的改變，肥胖的發(fā)病率逐年升高，常常導(dǎo)致血脂增高，并誘發(fā)高血壓、腦卒中、冠心病以及心肌梗死等心腦血管疾病[18-19]。目前上市的減肥非處方藥奧利司他是一種胃腸道脂肪酶抑制劑[20]，可通過減慢胃腸道中食物脂肪的水解和吸收，從而減少體內(nèi)脂肪貯存[21]。但奧利司他常伴有胃腸道不良反應(yīng)，且可抑制脂溶性維生素的水解和吸收，易導(dǎo)致維生素缺乏，甚至存在引發(fā)結(jié)腸癌和乳腺癌的危險(xiǎn)[22-24]。傳統(tǒng)中藥在治療肥胖等相關(guān)疾病中具有較好的效果[25-26]，因此，開發(fā)和拓展傳統(tǒng)中藥的減肥作用十分必要。

澤瀉為我國傳統(tǒng)中藥，具有利水滲濕、泄熱、化濁降脂的功效;23-乙酰澤瀉醇B為澤瀉中的三萜類成分，具有良好的降血脂、降血糖、保肝和抗癌抗菌等多種生理活性[27-28]。基于此，本研究擬探討23-乙酰澤瀉醇B對肥胖模型小鼠糖脂代謝紊的改善作用。

肥胖常常誘發(fā)慢性炎癥產(chǎn)生，表現(xiàn)為TNF-α、IL-6等炎癥因子水平的升高[29-30]。NF-κB一方面可增加趨化因子的分泌和脂肪細(xì)胞的合成;另一方面可促使TNF-α和IL-6等炎癥因子的大量釋放，導(dǎo)致機(jī)體組織炎癥反應(yīng)加劇，進(jìn)而促進(jìn)肥胖的進(jìn)展[31]。PPAR-γ在脂肪形成和分解中具有重要作用：其可抑制脂肪細(xì)胞表達(dá)TNF-α;還可刺激脂肪組織中多種參與游離脂肪酸代謝的基因的表達(dá)，從而降低血脂水平，改善肥胖[32-34]。本研究發(fā)現(xiàn)，肥胖模型小鼠灌胃23-乙酰澤瀉醇B 4周后，其脂肪細(xì)胞排列緊密、體積較小，肝細(xì)胞輕中度腫脹，可見少量細(xì)胞漿疏松淡染或呈空泡狀，以及少量肝細(xì)胞伴脂肪變性和炎性細(xì)胞小灶性浸潤;其體質(zhì)量、腰圍、脂肪和體液質(zhì)量均減少，血清中TC、TG、血糖、TNF-α、IL-6水平和肝組織中NF-κB水平均降低。本研究還發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，23-乙酰澤瀉醇B各劑量組小鼠肝組織中PPAR-γ的水平顯著升高，而奧利司他組的PPAR-γ水平顯著降低，其原因可能是因?yàn)閵W利司他是胃腸道脂肪酶抑制劑，主要通過調(diào)節(jié)胃腸道作用來改善肥胖。由此說明，23-乙酰澤瀉醇B可改善肥胖模型小鼠的血脂、血糖、肥胖調(diào)控因子和炎癥因子水平，從而發(fā)揮改善肥胖所致糖脂紊亂的作用。

綜上所述，23-乙酰澤瀉醇B可改善肥胖模型小鼠的糖脂代謝紊亂，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PPAR-γ、NF-κB、TNF-α、IL-6水平有關(guān)。本研究結(jié)果可為23-乙酰澤瀉醇B防治肥胖提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2020-12-14 修回日期：2021-02-21）

（編輯：唐曉蓮）