魏晴 梁珊珊 姜珊珊 魏娜

中圖分類號(hào) R285.5;R573.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）09-1063-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.09.07

摘 要 目的：研究良附丸治療胃潰瘍的作用機(jī)制。方法：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)（TCMSP）、GeneCards、OMIM和DisGeNET等數(shù)據(jù)庫，篩選良附丸的活性成分、靶點(diǎn)和胃潰瘍相關(guān)靶點(diǎn)，并利用Venny 2.1軟件篩選良附丸活性成分與胃潰瘍的共同靶點(diǎn);通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建良附丸治療胃潰瘍的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，并利用Cytoscape 3.7.2軟件對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?通過DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)良附丸的活性成分與胃潰瘍的共同靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，并構(gòu)建良附丸活性成分-胃潰瘍靶點(diǎn)-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)圖。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中，取小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、雷尼替丁組（陽性對(duì)照，39 mg/kg）和良附丸低、中、高劑量組（0.78、1.56、3.12 g/kg），分別灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)7天。末次給藥后，除空白組外，其余各組小鼠灌胃無水乙醇（0.01 mL/g），以復(fù)制胃潰瘍模型。造模成功后，取小鼠胃組織觀察病變情況，并計(jì)算胃潰瘍指數(shù);檢測(cè)小鼠胃組織中TP53、c-Jun、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：共篩選出良附丸中的9個(gè)活性成分（如異鼠李素、β-谷甾醇、山柰酚等）和166個(gè)共同靶點(diǎn)。良附丸可通過細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激的反應(yīng)、蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞外空間等GO功能，以及癌癥信號(hào)通路、乙型肝炎、膀胱癌、胰腺癌、TNF信號(hào)通路、前列腺癌等KEGG通路發(fā)揮治療胃潰瘍作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，良附丸能顯著降低小鼠胃組織病變情況和胃潰瘍指數(shù)，以及TP53、c-Jun、p38 MAPK、Akt、p-Akt和TNF-α蛋白的表達(dá)水平（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：篩選出了良附丸治療胃潰瘍的9個(gè)活性成分和166個(gè)靶點(diǎn);良附丸可通過抑制MAPK、NF-κB、TNF和PI3K/Akt等多條通路等，抑制炎癥因子的表達(dá)，從而發(fā)揮改善胃潰瘍的作用。

關(guān)鍵詞 良附丸;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);胃潰瘍;作用機(jī)制;小鼠

Study on Network Pharmacology Mechanism of Liangfu Pills in the Treatment of Gastric Ulcer

WEI Qing1，LIANG Shanshan1，JIANG Shanshan1，WEI Na2（1. College of Pharmacy， Guizhou University of TCM， Guiyang 550025， China; 2. College of Pharmacy， Hainan Medical University， Haikou 570100， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the mechanism of Liangfu pills in the treatment of gastric ulcer. METHODS： Based on network pharmacology， the active ingredients， targets and gastric ulcer related targets of Liangfu pill were screened by searching TCMSP， GeneCards， OMIM and DisGeNET databases， and the common targets of Liangfu pill and gastric ulcer were screened by Venny 2.1 software. The protein interaction network of Liangfu pill in the treatment of gastric ulcer was constructed by STRING database. Cytoscape 3.7.2 software was used to construct topological analysis of the network.The function of GO and the enrichment of KEGG pathway were analyzed by DAVID database. Active component-gastric ulcer target-KEGG pathway network was constructed for Liangfu pill. In animal experiment， mice were randomly divided into blank group， model group， ranitidine group （positive control， 39 mg/kg）， Liangfu pill low-， medium- and high- dose groups （0.78， 1.56， 3.12 g/kg）， and were given corresponding drugs intragastrically， once a day， for consecutive 7 days. After last administration， except for blank group， the other groups were given absolute ethanol （0.01 mL/g） intragastrically to induce the gastric ulcer model. After modeling， the pathological changes of gastric tissue were observed and the gastric ulcer index was calculated; the expression of TP53， c-Jun， p38 MAPK， Akt， p-Akt and TNF-α protein in gastric tissues of mice were detected. RESULTS： A total of 9 active ingredients? ? ? ? ? ?（i.g. isorhamnetin， β-gsterol， kaempferol） and 166 common targets were screened in Liangfu pills. Liangfu pill can treat gastric ulcer through GO functions such as cell response to chemical stimulation， protein binding and extracellular space， and KEGG pathways such as cancer signaling pathway， hepatitis B， bladder cancer， pancreatic cancer， TNF signaling pathway and prostate. The results of animal experiments showed that compared with model group， Liangfu pills could significantly reduce the pathological changes of gastric tissue and gastric ulcer? ?index， as well as the protein expression of TP53， c-Jun， p38 MAPK， Akt， p-Akt and TNF-α （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： The 9 active components and 166 targets of Liangfu pill were screened out. Liangfu pill can inhibit the expression of inflammatory factors by inhibiting MAPK， NF-κB， TNF and PI3K/Akt signaling pathway， and thus play an important role in improving gastric ulcer.

KEYWORDS? ?Liangfu pills; Network pharmacology; Gastric ulcer; Mechanism; Mice

胃潰瘍是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，隨著人們年齡增長(zhǎng)和工作壓力的增加，胃潰瘍的發(fā)病率不斷升高;胃潰瘍的形成是一個(gè)復(fù)雜的多因素過程，與保護(hù)性和侵襲性因子之間的生物學(xué)平衡失調(diào)及胃黏膜損害有關(guān)[1-2]。慢性飲酒、吸煙、壓力、幽門螺桿菌感染等是導(dǎo)致消化性潰瘍的最常見原因，若治療不及時(shí)，患者胃部可出現(xiàn)出血、穿孔、梗阻，甚至癌變等并發(fā)癥[3]。

良附丸始載于清代《良方集腋》，由高良姜Alpinia officinarum Hance和香附Cyperus rotundus L.兩味藥組成，具有疏肝理氣、溫胃祛寒的功效，臨床常用于胃痛、消化性潰瘍、胃癌、膽囊炎的治療[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，良附丸具有抗應(yīng)激性潰瘍，降低胃腸蠕動(dòng)、胃酸酸度和胃蛋白酶活性，以及抗炎鎮(zhèn)痛的藥理作用[5]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)的理論為基礎(chǔ)，應(yīng)用組學(xué)、網(wǎng)絡(luò)可視化等多種方法，建立系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)模型，從整體上考察藥物對(duì)疾病的干預(yù)與影響，揭示藥物、疾病、靶點(diǎn)與通路之間的復(fù)雜關(guān)系，對(duì)中藥作用機(jī)制以及新藥研發(fā)具有重要意義[6-8]?；诖?，本課題組采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，挖掘良附丸治療胃潰瘍的活性成分，預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路，探討良附丸抗胃潰瘍的作用機(jī)制，并進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以期為良附丸的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：VictorTMX3型多標(biāo)記微孔板酶標(biāo)儀（美國PekinEImer公司），TDL-4型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），SZN45N-B4舜宇體視顯微鏡（河南予華儀器有限公司），Trans-Blot Turbo型全能型蛋白轉(zhuǎn)膜儀、Power Pac Basic 型電泳儀（美國BioRad公司），Odyssey紅外熒光掃描系統(tǒng)（美國LI-COR公司），R-200 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本Buchi公司）。

1.2 主要藥品與試劑

高良姜和香附均購自廣州弘聯(lián)醫(yī)藥藥材有限公司（批號(hào)分別為20201105、20201112），經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定分別為姜科山姜屬植物高良姜A. officinarum Hance的干燥根莖和莎草科植物莎草C. rotundus L.的干燥根莖;所用藥品與試劑主要有鹽酸雷尼替丁膠囊（山西云鵬制藥有限公司，批號(hào)G180402，規(guī)格按雷尼替丁計(jì)為0.15 g），無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20201011，純度99.0%），小鼠胃泌素（GAS）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（武漢華聯(lián)科生物工程有限公司，批號(hào)分別為20190618、20200613、20200606），兔源細(xì)胞腫瘤抗原p53（TP53）單克隆抗體、兔源c-Jun單克隆抗體、兔源p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）多克隆抗體、兔源蘇氨酸激酶（Akt）多克隆抗體、兔源磷酸化Akt（p-Akt）多克隆抗體、兔源腫瘤壞死因子α（TNF-α）單克隆抗體（美國Abcam公司，批號(hào)分別為ab32049、ab40766、ab120235、ab38449、ab8805、ab109322），兔源GAPDH多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（美國Cell Signaling Technology公司，批號(hào)分別為5794s 、7074），BCA蛋白定量試劑盒（福州飛凈生物技術(shù)有限公司，批號(hào)PH0326），ECL超敏化學(xué)發(fā)光液（新賽美生物科技有限公司，批號(hào)P10100），哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)78502），蛋白酶抑制劑、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為P1065、P0012A）;其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為SPF級(jí)雄性昆明小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量（19±2） g，購自湖南長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)為SCXK（湘）2019-0014。所有小鼠均飼養(yǎng)于12 h/12 h明暗交替的房間內(nèi)，室內(nèi)溫度為（25.0±1.0） ℃、相對(duì)濕度為（50.0±10.0）%，均給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水喂養(yǎng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 良附丸活性成分的篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過檢索中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）收集良附丸組方中藥高良姜和香附的化學(xué)成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性指數(shù)（DL）≥0.18為篩選條件[9]，結(jié)合文獻(xiàn)[10-12]確定高良姜和香附的活性成分，然后在TCMSP中點(diǎn)擊“活性成分”選項(xiàng)，得到活性成分所對(duì)應(yīng)的潛在蛋白靶點(diǎn);將所有靶點(diǎn)合并去重后，通過Unipot數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）對(duì)蛋白名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，即得到良附丸的潛在作用靶點(diǎn)。結(jié)果，共篩選出良附丸的9個(gè)活性成分，如異鼠李素、β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素等，并獲得206個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。良附丸活性成分信息見表1。

2.2 良附丸活性成分與胃潰瘍的共同靶點(diǎn)篩選

以“Gastric ulcer”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）、DisGeNET數(shù)據(jù)庫（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）中檢索收集胃潰瘍相關(guān)的靶點(diǎn)基因，去重后即得到胃潰瘍的相關(guān)靶點(diǎn)3 724個(gè)。將“2.1”項(xiàng)下收集的206個(gè)良附丸活性成分的潛在作用靶點(diǎn)和胃潰瘍的相關(guān)靶點(diǎn)共同映射，通過Venny 2.1軟件，尋找出兩者共同的靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。結(jié)果，共獲得166個(gè)共同靶點(diǎn)，詳見圖1。

2.3 良附丸治療胃潰瘍的蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“2.2”項(xiàng)下的共同靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）中，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置置信度大于0.7，其他參數(shù)設(shè)置不變，去掉網(wǎng)絡(luò)中的單一節(jié)點(diǎn)，獲得PPI結(jié)果。將PPI結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行拓?fù)浞治觯x取Degree大于中位數(shù)2倍（即19）以上，且Betweenness大于中位數(shù)（即0.013）的靶點(diǎn)作為良附丸治療胃潰瘍的核心靶點(diǎn)。結(jié)果，構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)共有164個(gè)節(jié)點(diǎn)、3 250條邊，詳見圖2。經(jīng)拓?fù)浞治龉驳玫?5個(gè)核心靶點(diǎn)，分別為TP53、c-Jun、Akt1、MAPK1（絲裂原活化蛋白激酶1）、TNF-α、HSP90AA1（熱休克蛋白90α編碼基因）、NF-κB（核因子κB p65）、CXCL8（趨化因子配體8）、IL-6、MAPK14、MAPK8、RB1（視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因1）、ESR1（雌激素受體α）、VEGFA（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）和CCND1（細(xì)胞周期素1）。

2.4 GO功能與KEGG通路富集分析

將“2.2”項(xiàng)下的共同靶點(diǎn)輸入DAVIAD數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行基因本體（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，以P<0.05篩選排名前10位的顯著富集的GO功能和排名前15位的KEGG通路。采用Cytoscape 3.7.2軟件中的Merge功能，構(gòu)建良附丸活性成分-胃潰瘍靶點(diǎn)-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)圖，并篩選Degree值排名前5位的靶點(diǎn)。結(jié)果，良附丸治療胃潰瘍的GO功能主要包括Cellular response to chemical stimulus（細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激的反應(yīng)）、Response to chemical（對(duì)化學(xué)反應(yīng)）、Positive regulation of biological process（積極調(diào)控生物過程）等生物過程，Identical protein binding（蛋白質(zhì)結(jié)合）、Protein dimerization activity（蛋白質(zhì)二聚活性）、Steroid hormone receptor activity（類固醇激素受體活性）等分子功能，以及Extracellular space（細(xì)胞外空間）、Cytosol（細(xì)胞質(zhì)溶膠）、Membrane Microdomain（膜微區(qū)）等細(xì)胞成分，詳見圖3。共篩選出癌癥、乙型肝炎、膀胱癌、胰腺癌、TNF信號(hào)通路、前列腺癌等KEGG通路，詳見表2。構(gòu)建的良附丸活性成分-胃潰瘍靶點(diǎn)-KEGG通路共有節(jié)點(diǎn)185個(gè)、邊453條，詳見圖4。Degree值排名前5位的靶點(diǎn)分別為TP53、c-Jun、Akt1、MAPK1、TNF-α。

2.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

基于上述篩選的良附丸治療胃潰瘍排名前5位的靶點(diǎn)蛋白（TP53、c-Jun、Akt1、MAPK1、TNF）進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以探討良附丸對(duì)胃潰瘍的治療作用并驗(yàn)證相關(guān)靶點(diǎn)。MAPK可分為細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、p38、JNK和ERK5這4個(gè)亞族，其中，ERK廣泛存在于各種組織，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化;JNK家族是細(xì)胞對(duì)各種應(yīng)激原誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子，參與細(xì)胞對(duì)輻射、滲透壓、溫度變化等應(yīng)激反應(yīng); p38主要介導(dǎo)炎癥、凋亡等[13]。由于胃潰瘍的產(chǎn)生多與炎癥相關(guān)，因此選擇MAPK亞蛋白p38 MAPK蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。

2.5.1 良附丸藥液的制備 分別稱取高良姜和香附藥材各100 g，置于燒瓶中，加入1 600 mL水煎煮3次，每次2 h;過濾，合并3次濾液，于45 ℃水浴條件下減壓旋蒸濃縮至1 g/mL（以生藥量計(jì)，下同）。

2.5.2 分組、造模與給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 天后，隨機(jī)分成空白組、模型組、雷尼替丁組（陽性對(duì)照，39 mg/kg，根據(jù)臨床等效劑量換算而得）和良附丸低、中、高劑量組（0.78、1.56、3.12 g/kg，劑量分別按臨床等效劑量的1、2、4倍換算而得），每組10只?？瞻捉M、模型組大鼠灌胃生理鹽水，其余各組小鼠灌胃相應(yīng)藥物（臨用時(shí)以水溶解或稀釋），灌胃體積均為10 mL/ g，每天1次，連續(xù)7 天。小鼠末次給藥前禁食不禁水24 h，末次給藥1 h后，除空白組外，其余組小鼠均一次性灌胃無水乙醇（0.01 mL/g）以復(fù)制胃潰瘍模型。取3只模型組小鼠進(jìn)行解剖，取其胃組織，參考文獻(xiàn)[14-15]方法，測(cè)定小鼠胃潰瘍指數(shù)。具體測(cè)定方法為：于體視顯微鏡下觀察胃黏膜出血、潰瘍的情況，測(cè)量所有潰瘍面的長(zhǎng)徑并打分;長(zhǎng)徑≤1 mm者計(jì)為1分，>1～2 mm者計(jì)為2分，>2～3 mm者計(jì)為3分，>3～4 mm者計(jì)為4分，>4 mm者計(jì)為5分，合并所有潰瘍面的計(jì)分即為小鼠潰瘍指數(shù)。當(dāng)小鼠胃潰瘍指數(shù)大于20分時(shí)，表明造模成功。

2.5.3 樣品采集 各組小鼠灌胃無水乙醇后，繼續(xù)禁食不禁水1 h，然后摘眼球取血，血樣以4 000 r/min離心15 min，取上層血清，于-20 ℃保存，備測(cè)。取血后，各組小鼠均脫頸椎處死，剖腹取全胃，沿胃大彎剪開，用生理鹽水洗凈，備用。

2.5.4 小鼠胃組織觀察和胃潰瘍指數(shù)的測(cè)定 取“2.5.3”項(xiàng)下各組小鼠的胃組織進(jìn)行肉眼觀察，并計(jì)算其胃潰瘍指數(shù)。采用GraphPad Prime 8.0.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn);P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（以下各項(xiàng)測(cè)定的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法相同）。結(jié)果，空白組小鼠胃黏膜完整，無黏膜糜爛跡象;模型組小鼠胃組織可見出血性壞死和潰瘍性血斑;與模型組比較，雷尼替丁組和良附丸各劑量組小鼠胃黏膜損傷均減輕，潰瘍指數(shù)均顯著降低（P<0.05或P<0.01，低劑量組除外），詳見圖5、表3。

2.5.5 小鼠胃組織中TP53、c-Jun、p38 MAPK、Akt、p-Akt和TNF-α蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)。取“2.5.3”項(xiàng)下的小鼠胃組織（良附丸組只測(cè)定高劑量組）適量，于冰上研碎至勻漿后，在4 ℃條件下以13 000 r/min離心10 min，取部分上清液，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白經(jīng)煮沸變性后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳，然后轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h;以TBST洗滌3次，分別加入TP53、c-Jun、? ? ?p38 MAPK、Akt、p-Akt、TNF-α、GAPDH一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃下孵育過夜;以TBST洗滌3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 6 000），室溫孵育2 h;以TBST洗滌3次，經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光液顯色后，于凝膠成像分析系統(tǒng)上成像。使用Image J 1.8.0軟件分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參（GAPDH）蛋白條帶的灰度值的比值作為目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。上述操作重復(fù)3次。結(jié)果，與空白組比較，模型組小鼠胃組織中TP53、c-Jun、p38 MAPK、Akt、p-Akt和TNF-α蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，雷尼替丁組和良附丸高劑量組小鼠胃組織中上述5種蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖6、表4。

3 討論

良附丸能夠治療肝郁氣滯、胃有寒凝、脘腹疼痛、胸脅脹痛、痛經(jīng)等疾病[6]，其在臨床上的療效已被廣泛認(rèn)可，但其作用機(jī)制尚不明確[16]。為了進(jìn)一步研究良附丸治療胃潰瘍的作用機(jī)制，本文先應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)良附丸中的活性成分進(jìn)行篩選，并預(yù)測(cè)其治療胃潰瘍的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路;然后，基于關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選結(jié)果，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以期為后續(xù)良附丸作用機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，從良附丸中共篩選出9個(gè)活性成分，包括異鼠李素、山柰酚、槲皮素等。相關(guān)研究表明，槲皮素和山柰酚可顯著改善大鼠經(jīng)乙醇、鹽酸、吲哚美辛、幽門結(jié)扎等因素誘導(dǎo)的胃潰瘍，且可有效減輕其氧化應(yīng)激，減少胃酸的分泌，從而起到抗胃潰瘍的作用[17-19]。這提示黃酮類化合物對(duì)胃潰瘍有一定的治療作用。

本研究通過TCMSP、OMIM、DisGeNET和Genecards等數(shù)據(jù)庫共篩選出良附丸活性成分和胃潰瘍的共同基因166個(gè);進(jìn)一步通過STRING數(shù)據(jù)庫和Cytospace軟件篩選出15個(gè)核心靶點(diǎn);然后通過DAVIAD網(wǎng)站進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，構(gòu)建良附丸活性成分-胃潰瘍靶點(diǎn)-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)圖;并依據(jù)Degree值，篩選了排名前5位的靶點(diǎn)，包括TP53、c-Jun、Akt1、MAPK1、TNF-α。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，TP53蛋白表達(dá)的升高會(huì)引起胃黏膜相關(guān)的炎癥反應(yīng)，從而引發(fā)潰瘍;此外，TP53還可調(diào)控細(xì)胞周期G1、G2期并介導(dǎo)凋亡，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的作用[20]。MAPK通路是細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的主要途徑，參與了細(xì)胞外信號(hào)從細(xì)胞表面到內(nèi)部的信號(hào)傳導(dǎo)過程;當(dāng)MAPK通路激活后，可促使ERK和p38 MAPK轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中[13]。一方面，活化的ERK1/2可促進(jìn)c-Jun的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)Bcl-2家族促凋亡成員的線粒體透化作用來上調(diào)黏膜細(xì)胞凋亡[21];另一方面，p38 MAPK轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核后，主要參與機(jī)體細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖分化、凋亡及炎癥等重要過程，而且活化的p38 MAPK可以調(diào)控下游多種酶及轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)，促使局部組織發(fā)生急性炎癥、凋亡等病理改變[22-23]。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，胃潰瘍模型大鼠胃黏膜中的PI3K、Akt mRNA和蛋白的表達(dá)水平均升高，經(jīng)藥物干預(yù)后，大鼠胃黏膜中的上述指標(biāo)的表達(dá)水平均降低[24]。由此說明，PI3K/Akt信號(hào)通路可參與調(diào)控胃潰瘍模型大鼠的胃黏膜病變。

研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α由巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生，能夠刺激線粒體，還可以激活黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生超氧陰離子，進(jìn)而刺激TLR（Toll樣受體）蛋白，激活NF-κB轉(zhuǎn)錄因子;活化的NF-κB能促進(jìn)下游靶細(xì)胞釋放更多的TNF-α[25]。在應(yīng)激性狀態(tài)下，TNF-α能引起大量中性粒細(xì)胞聚集，從而使得胃黏膜受損，進(jìn)一步導(dǎo)致潰瘍的形成[26]。相關(guān)研究表明，胃潰瘍模型大鼠胃黏膜中NF-κB和TNF-α的蛋白的表達(dá)水平均升高;經(jīng)藥物干預(yù)后，大鼠胃黏膜中的上述指標(biāo)的表達(dá)水平均降低[27-28]。由此說明，NF-κB或TNF信號(hào)通路可參與調(diào)控胃潰瘍的發(fā)生。

本研究對(duì)小鼠灌胃良附丸藥液后，再一次性灌胃乙醇，以復(fù)制胃潰瘍模型小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，良附丸可降低小鼠胃組織中TP53、c-Jun、p38 MAPK、Akt、p-Akt和TNF-α蛋白的表達(dá)水平。這提示良附丸可能通過抑制MAPK、NF-κB、TNF和PI3K/Akt等多條通路共同改善胃潰瘍，由此也驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的良附丸中活性成分對(duì)于胃潰瘍靶點(diǎn)的作用。

綜上所述，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出了良附丸治療胃潰瘍的9個(gè)活性成分和166個(gè)靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)可通過多種信號(hào)通路共同發(fā)揮治療作用;經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，良附丸可通過抑制MAPK、NF-κB、TNF和PI3K/Akt等多條通路，抑制炎癥因子的表達(dá)，從而發(fā)揮改善胃潰瘍的作用。

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（收稿日期：2021-01-15 修回日期：2021-02-26）

（編輯：唐曉蓮）