曹葉中 蔡文

摘要 [目的]建立液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）同時(shí)檢測牛奶和奶粉中的5種黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1的方法。 [方法]樣品用含0.5%乙酸乙腈為提取溶劑，通過硫酸鎂和氯化鈉促進(jìn)水-乙腈分層，經(jīng)正己烷除脂凈化后用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行檢測。[結(jié)果]各黃曲霉毒素線性范圍為1.0～5.0 ng/mL，確定系數(shù)（R2）均大于0.999 0;牛奶加標(biāo)平均回收率為77.06%～101.28%，RSD為2.38%～722%;奶粉加標(biāo)平均回收率為57.00%～99.86%，RSD為2.00%～8.37%。 [結(jié)論]該方法可同時(shí)測定牛奶和奶粉中的5種黃曲霉毒素，具有操作方便、分析速度快、選擇性強(qiáng)、定性準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可用作牛奶和奶粉中黃曲霉毒素的定量測定。

關(guān)鍵詞 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù);牛奶;奶粉;黃曲霉毒素;測定

中圖分類號(hào) TS.252.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2021）02-0201-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.02.054

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Optimization of Aflatoxin Determination Methods in Milk and Milk Powder by HPLCMS

CAO Yezhong， CAI Wen

（Suzhou Food Inspection and Testing Center， Suzhou， Jiangsu215000）

Abstract [Objective] To establish a high performance liquid chromatographymass spectrometry （HPLCMS） method for the detection of five aflatoxin B1， B2， G1， G2， M1 in milk and milk powder. [Method] The sample was extracted from acetonitrile containing 0.5% acetate， and the wateracetonitrile was stratified by magnesium sulfate and sodium chloride. Then the sample was purified by nhexane and then detected by HPLCMS. [Result] There was a good relationship between the area ratios of the monitored ion peaks and the mass concentration linearity in the linear range of 0-5.0 ng/mL. All the R2 were better than 0.999. The recovery range of milk was 77.06%-101.28%， and RSD was 2.38%-7.22%;the recovery rate of milk powder was 57.00%-99.86%， RSD was 2.00%-8.37%. [Conclusion] The method can be used for the quantitative determination of five aflatoxin in milk and milk powder at the same time， with the advantages of convenient operation， fast analysis， strong selectivity and accurate qualitative determination.

Key words High performance liquid chromatographymass spectrometry;Milk;Milk powder;Aflatoxin;Determination

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是由黃曲霉、寄生曲霉和少量特異曲霉產(chǎn)生的次生毒性代謝物[1]，常見類型分別為B1、B2、G1、G2、M1、M2等，其中B1對(duì)人類健康的危害最大，被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為1類致癌物[2]。人們接觸黃曲霉毒素的主要來源是污染的食物，在熱帶和亞熱帶等濕熱地區(qū)，黃曲霉毒素對(duì)花生、核桃、玉米、稻米、大豆、小麥等糧油產(chǎn)品的污染概率最高[3]。M1主要在牛奶中存在[4]，養(yǎng)殖奶牛的飼料在被AFB1污染后，奶中會(huì)產(chǎn)生AFB1的羥基化代謝產(chǎn)物AFM1[5]，對(duì)人類健康造成極大威脅。

目前國內(nèi)外對(duì)牛奶和奶粉中的黃曲霉毒素，除了M1之外，其他均未單獨(dú)制定殘留限量標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)行的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1664—2005[6]和國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23212—2008[7]是采用液相色譜熒光檢測法測定牛奶、奶粉中的5種黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1。此檢測流程需要經(jīng)過免疫親和柱凈化，再分別利用過溴化吡啶和三氟乙酸進(jìn)行衍生化處理，最后通過帶有熒光檢測器的高效液相色譜儀測定[8-9]。但該檢測手段操作繁瑣、耗費(fèi)時(shí)間長，且免疫親和柱的成本頗高，同時(shí)受到氮?dú)饬鲝?qiáng)度等外界因素的影響，容易出現(xiàn)衍生化反應(yīng)不穩(wěn)定、回收率低和重現(xiàn)性差、假陽性結(jié)果等現(xiàn)象[10]。因此，建立簡單、快速、準(zhǔn)確的AFT檢測方法十分必要。筆者基于HPLC-MS技術(shù)對(duì)5種黃曲霉毒素的測定方法進(jìn)行優(yōu)化，旨在為牛奶和奶粉中黃曲霉毒素殘留的定量測定和確證檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品。

寧波鮮牛奶，惠氏奶粉（0～6個(gè)月段）。

1.1.2 主要儀器。

三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（AB Scies API 4000，沃譜達(dá)儀器蘇州有限公司）;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（H1850R，湖南湘儀儀器廠）;塑料離心管（Falcon，美國BD公司）;套式恒溫器（TC-15，新華醫(yī)療器械廠）;高效液相色譜儀（Agilent 1290，美國Agilent公司）;Analyst軟件（Versin 2.4，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.1.3 主要試劑。

黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品B1、B2、G1、G2、M1：上海安譜科技公司;乙腈：色譜純，美國TEDIA;氯化鈉、硫酸鎂：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙酸：分析純，上海阿拉丁生化科技有限公司;正己烷：分析純，上虞市雙良化工設(shè)備有限公司;N-丙基乙二胺（PSA）：分析純，北京中儀宇盛科技有限公司;C18粉：分析純，上海博勢生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化。

黃曲霉毒素不溶于非極性溶劑，但可以在有機(jī)溶劑中溶解，因此一般用甲醇或乙腈作為提取劑。雖然黃曲霉毒素難溶于水，但如果提取過程中有一定比例水存在，就可以在提取時(shí)提高有機(jī)溶劑的滲透率，萃取效率也會(huì)提高[11]。因此，該研究采用乙腈（含乙酸）和水混合液作為提取液。

目前檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1664—2005和國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23212—2008中，主要是采用免疫親和柱，在柱內(nèi)形成特定的抗原-抗體復(fù)合物，這種凈化方法專一性強(qiáng)。但對(duì)于企業(yè)來講，該方法檢測成本高，尤其對(duì)于牛奶和奶粉樣品，加水后樣品易混濁，過柱時(shí)間長。故該研究采用類似于QuEChERS[12]的前處理方法，即用5 g MgSO4∶NaCl（4∶1）進(jìn)行提取，然后通過正己烷完成除脂凈化，使提取過程更加方便經(jīng)濟(jì)。

1.2.2 樣品前處理。

分別準(zhǔn)確稱取5.0 g牛奶和2.0 g奶粉（精確至0.001 g）到50 mL塑料離心管內(nèi)，奶粉另加入2 mL超純水。在樣品中加入黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，加入乙腈（含0.5%乙酸）+水20 mL，樣品經(jīng)過5 min高速混勻后放入50 ℃水浴中超聲15 min，然后高速離心5 min（轉(zhuǎn)速8 000 r/min），取上清液10 mL至離心管中，采用4種不同的提取和凈化方法（表1），用50 ℃下氮?dú)饬鞔蹈桑尤?.0 mL乙腈+水（含0.5%乙酸）（1∶1）將壁上的殘留溶解，用0.22 μm尼龍濾膜過濾到進(jìn)樣瓶中。

1.2.3 液相條件的選擇。

為優(yōu)化5種黃曲霉毒素的分離條件，選擇合適的色譜柱，經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[13-14]，多采用BEH C18或類似色譜柱。該研究采用適于酸性條件的常用色譜柱SB-C18（4.6 mm×150 mm×5 μm），柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速0.8 mL/min，流動(dòng)相A為乙腈（0.1%乙酸），流動(dòng)相B為水（0.1%乙酸）。梯度程序?yàn)椋? min B 90%、10 min B 10%、12 min B 10%、12.1 min B 90%、15 min B 90%，2 μg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑、凈化條件的選擇

對(duì)牛奶和奶粉前處理中不同提取和凈化過程的回收率進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，處理①牛奶中5種黃曲霉毒素的回收率較高，且較為穩(wěn)定;奶粉中雖然采用處理④的回收率最高，但綜合考慮回收率和成本等因素，處理①的凈化過程對(duì)牛奶和奶粉的回收率較好。因此，本研究選用處理①的方法，即用5 g MgSO4∶NaCl（4∶1）進(jìn)行提取，然后通過正己烷除脂凈化。

2.2 質(zhì)譜優(yōu)化條件

分別吸取5 μg/mL黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，運(yùn)用電噴霧（ESI）電離，用針泵注入離子源時(shí)用10 μL/min流速，利用一級(jí)質(zhì)譜分析（Q1掃描）技術(shù)，分析物在正離子掃描下可以得到分子離子峰。

在正離子模式下，5種黃曲霉毒素均可以得到很強(qiáng)的[M+H]+信號(hào)，對(duì)去簇電壓優(yōu)化，得到強(qiáng)度最大的分子離子峰，然后運(yùn)用2級(jí)的質(zhì)譜分析（子離子掃描）黃曲霉毒素化合物的分子離子峰，使碎片離子峰的強(qiáng)度提高可以通過優(yōu)化碰撞能量實(shí)現(xiàn)。優(yōu)化條件如表2所示。

為選取豐度較強(qiáng)、影響較小的2對(duì)子離子為定性離子需要優(yōu)化撞擊的能量。對(duì)其他參數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化，可以得到最佳質(zhì)譜檢測條件：離子噴霧電壓IS，4 500 V;霧化氣GS1，4.14×105 Pa;輔助加熱氣溫度TEM，500 ℃;幕簾氣CUR，1.38×105 Pa;碰撞氣CAD，0.69×105 Pa;去溶劑氣GS2，4.14×105 Pa;入口電壓EP，10 V。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)影響

有研究表明，樣品基質(zhì)會(huì)對(duì)大氣壓噴霧電離的離子源（ESI）產(chǎn)生一定的影響[15]。該研究采用外標(biāo)定量法，能更好地降低基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響。為了測定結(jié)果更加準(zhǔn)確，采用基質(zhì)加標(biāo)工作曲線，從而消除操作過程中的系統(tǒng)誤差。結(jié)果顯示，牛奶和奶粉的基質(zhì)效應(yīng)影響較小，均小于10%（表3）。

2.4 線性關(guān)系和檢測限

用初始流動(dòng)相制備黃曲霉毒素01、0.5、1.0、2.0、5.0 ng/mL不同基質(zhì)的加標(biāo)工作曲線，進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用檢測分析，

以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，對(duì)峰面積與質(zhì)量濃度進(jìn)行線性擬合。

結(jié)果顯示，監(jiān)測的峰面積與質(zhì)量濃度在1.0～5.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2都大于0.999 0，能夠滿足樣品測定標(biāo)準(zhǔn)及要求（表4）。根據(jù)各定量離子色譜峰3～10倍信噪比（S/N），計(jì)算檢出限（LOD）和定量限（LOQ），結(jié)果見表4。

2.5 回收率及精密度

在不含黃曲霉毒素的空白樣品牛奶中分別添加1.25、2.50、5.00 ng （即0.25、0.50、1.00 μg/kg）不同黃曲霉毒素水平，奶粉中分別添加1.0、2.0、4.0 ng （即0.50、1.00、2.00 μg/kg）不同水平黃曲霉毒素，每個(gè)水平獨(dú)立測定6次。結(jié)果顯示，牛奶加標(biāo)回收率為77.06%～101.28%，RSD為2.38%～7.22%（表5）;奶粉加標(biāo)回收率的范圍在57.00%～99.86%，RSD為2.00%～8.37%（表6），說明該方法的回收率和精密度良好。

3 結(jié)論

（1）該研究通過對(duì)各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比，得到最優(yōu)的提取和凈化方法，通過對(duì)質(zhì)譜儀各項(xiàng)數(shù)據(jù)的調(diào)整，使檢測靈敏度達(dá)到最佳。各黃曲霉毒素線性范圍為1.0～5.0 ng/mL，R2均大于0.999 0，牛奶加標(biāo)平均回收率為77.06%～101.28%，RSD為2.38%～7.22%;奶粉加標(biāo)平均回收率為57.00%～99.86%，RSD為2.00%～8.37%，數(shù)據(jù)均符合標(biāo)準(zhǔn)。

（2）該研究建立了液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測定牛奶和奶粉中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1的方法，該方法操作方便快速，準(zhǔn)確度與靈敏度良好，可定量測定和確證檢測牛奶和奶粉中5種黃曲霉毒素的殘留。

參考文獻(xiàn)

[1] ISMAIL A，GONALVES B L，DE NEEFF D V，et al.Aflatoxin in foodstuffs：Occurrence and recent advances in decontamination[J].Food research international，2018，113：74-85.

[2] KHAYOON W S，SAAD B，LEE T P，et al.High performance liquid chromatographic determination of aflatoxins in chilli，peanut and rice using silica based monolithic column[J].Food chemistry，2012，133（2）：489-496.

[3] SPENCER SMITH J，PAUL WILLIAMS W，WINDHAM G L.Aflatoxin in maize：A review of the early literature from "moldycorn toxicosis" to the genetics of aflatoxin accumulation resistance[J].Mycotoxin research，2019，35（2）：111-128.

[4] 李松勵(lì)，閔力，高亞男，等.我國生鮮乳中黃曲霉毒素M1污染風(fēng)險(xiǎn)分析[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2018，30（12）：5202-5209.

[5] 熊力力，吳文旋，王翀，等.湖北省奶牛精料原料及牛奶中黃曲霉毒素污染調(diào)查[J].中國畜牧雜志，2019，55（2）：137-141.

[6] 李佐卿，康繼韜，孫大為，等.牛奶和奶粉中黃曲霉毒素M1、B1、B2、G1、G2含量的測定：SN/T 1664—2005[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006.

[7] 陳瑞春，段文仲，呂紅英，等.牛奶和奶粉中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的測定 液相色譜-熒光檢測法：GB/T 23212—2008[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

[8] 陳夢，鄒小龍，范蕾，等.高效液相色譜法測定牛奶中黃曲霉毒素M1含量的不確定度評(píng)定[J].分析測試技術(shù)與儀器，2020，26（1）：71-75.

[9] 李莉，金銘特.應(yīng)用高效液相色譜法檢測食品中黃曲霉毒素[J].食品安全導(dǎo)刊，2018（12）：104.

[10] 劉明理，曹進(jìn)，張慶生，等.牛奶及乳粉中黃曲霉毒素M1的液相色譜-質(zhì)譜檢測比較研究[J].藥物分析雜志，2017，37（3）：471-476.

[11] 劉英，胡建華，劉春朝.黃曲霉素毒理效應(yīng)及檢測方法[J].生物加工過程，2013，11（3）：83-88.

[12] 凌阿茹，郭文博，楊俊花，等.QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定畜禽組織中6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素[J].色譜，2018，36（5）：439-445.

[13] 鄭潤生，徐暉，王文麗，等.苦杏仁中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的液質(zhì)聯(lián)用檢測分析[J].中國中藥雜志，2013，38（20）：3534-3538.

[14] 童圓，張惠賢，周有祥，等.固相萃取-高效液相色譜熒光法測定液態(tài)奶制品中的黃曲霉毒素M1和B1[J].農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全，2017（2）：56-60.

[15] 蘇萌，艾連峰.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜基質(zhì)效應(yīng)及其消除方法[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2014，5（2）：511-515.