周子健，李 凱，蔡令凱，莊俊濤，楊 瀟，楊海偉，李鵬超，呂 強(qiáng)

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，江蘇南京 210029)

膀胱癌每年導(dǎo)致全球近17萬(wàn)人死亡，是全球第6大常見(jiàn)腫瘤[1]，具有進(jìn)展快、侵襲性強(qiáng)和預(yù)后不佳的臨床特點(diǎn)[2]，故探索其新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)至關(guān)重要[3]。N6-甲基腺嘌呤(m6A)是真核生物RNA中最常見(jiàn)的修飾之一，參與調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展[4-5]。胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA結(jié)合蛋白1(IGF2BP1)，屬于RNA結(jié)合蛋白家族的一員[6]，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和化療耐藥[7]。2018年，IGF2BP1首次被報(bào)道可以作為一種新的m6A閱讀蛋白，識(shí)別mRNA上保守的GG(m6A)C序列，促進(jìn)目標(biāo)mRNA的穩(wěn)定及其翻譯[8]。隨后研究發(fā)現(xiàn)，IGF2BP1以m6A修飾的方式促進(jìn)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SRF轉(zhuǎn)錄形成致癌驅(qū)動(dòng)網(wǎng)絡(luò)[9]。

本團(tuán)隊(duì)在之前的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)m6A甲基化蛋白METTL3能夠以m6A依賴的方式促進(jìn)膀胱癌腫瘤的增殖[10]，而本次研究主要探討m6A閱讀蛋白IGF2BP1在膀胱癌中的表達(dá)及作用。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源膀胱癌組織及其配對(duì)的癌旁組織均取自2010至2013年在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(江蘇省人民醫(yī)院)確診為膀胱癌并進(jìn)行手術(shù)的患者。隨訪的截止日期是2018年1月。所有患者都簽署知情同意書(shū)。本研究使用的臨床樣本已得到南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(江蘇省人民醫(yī)院)倫理委員會(huì)的證實(shí)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人膀胱癌細(xì)胞系T24、J82、BIU87、TCC細(xì)胞株和人正常膀胱上皮細(xì)胞系SV-HUC購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞分別用含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、F12K培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。FBS、胰蛋白酶和各類培養(yǎng)基均購(gòu)自Thermo公司。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染：按照LipofectamineTM3000說(shuō)明進(jìn)行siRNA的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染分為陰性siRNA轉(zhuǎn)染組(NC組)及干擾IGF2BP1表達(dá)的siRNA組(siRNA1和siRNA2)。siRNA由江蘇凱基生物公司設(shè)計(jì)及合成。簡(jiǎn)要操作如下：轉(zhuǎn)染前24 h，接種T24細(xì)胞(1×105個(gè)/孔)于6孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)到60%時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA及NC組，siRNA及LipofectamineTM3000分別溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中，制備成siRNA-Lip 3000混合物，轉(zhuǎn)染后于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～2 d。

1.4 免疫組化取膀胱組織標(biāo)本切片,常規(guī)脫蠟，抗原提取后，用IGF2BP1抗體(1∶100，Proteintech)封閉并染色，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution,PBS)代替一抗稀釋液作為陰性對(duì)照，具體染色實(shí)驗(yàn)步驟依據(jù)試劑盒進(jìn)行。結(jié)果判定：細(xì)胞中出現(xiàn)黃色或棕黃褐色為陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)陽(yáng)性計(jì)0分、陽(yáng)性細(xì)胞比例<25%計(jì)1分、25%～50%計(jì)2分、51%～75%計(jì)3分、>75%計(jì)4分。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)染色0分、淡黃色計(jì)1分、黃色計(jì)2分、棕黃色計(jì)3分。以陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分之和判斷癌組織和癌旁組織中IGF2BP1蛋白的表達(dá)，0～4分為陰性，5～7分為陽(yáng)性。

1.5 RNA提取和qRT-PCRTrizol法(Invitrogen,USA)提取的細(xì)胞和組織的總RNA，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)利用The Applied Biosystems Stepone Plus PCR System (Applied Biosystems，USA)和LightCycler 480(Roche，USA)儀器進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。β-actin用作內(nèi)參，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography,CT)值取平均值。根據(jù)擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出目的基因的CT值后，從而反映IGF2BP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR試劑購(gòu)自南京諾唯贊公司。PCR引物由南京擎科公司合成，IGF2BP1引物序列:上游TAGTACCAAGAGACCAGACCC，下游GATTTC TGCCCGTTGTTGTC；β-actin引物序列:上游AGC GAGCATCCCCCAAAGTT，下游GGGCACGAAG GCTCATCATT。

1.6 細(xì)胞增殖和克隆實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，以每孔1 000個(gè)細(xì)胞的密度將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種到96孔板中。接種后24、48、72、96 h分別采用細(xì)胞計(jì)數(shù)kit-8(CCK-8)系統(tǒng)測(cè)定細(xì)胞活力，用酶標(biāo)儀(Tecan，瑞士)在450 nm處測(cè)定吸光度值。對(duì)于克隆形成實(shí)驗(yàn)，將500個(gè)細(xì)胞接種到6孔板中并保持在完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)8 d，而后將克隆板在1.44 mol/L多聚甲醛中固定20 min，并用結(jié)晶紫染色液(碧云天生物公司)染色20 min后拍攝可見(jiàn)的群落。

1.7 生物信息學(xué)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中膀胱癌基因表達(dá)量數(shù)據(jù)的收集：在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載膀胱癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄譜的基因表達(dá)量數(shù)據(jù)(https://portal.gdc.cancer.gov/),數(shù)據(jù)類型為HTSeq-FPKM。獲得膀胱癌基因表達(dá)量數(shù)據(jù)420例,其中19例癌旁組織，411例腫瘤組織。之后提取19種m6A相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量并進(jìn)行數(shù)據(jù)校正，應(yīng)用R4.0.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及相應(yīng)圖形繪制，采用“heatmap”包進(jìn)行圖形繪制。評(píng)估m(xù)6A相關(guān)蛋白之間的交互關(guān)系：使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(http://stringdb.org)進(jìn)行m6A相關(guān)蛋白的相關(guān)性分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過(guò)t檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)分析兩組之間的差異，非配對(duì)樣本間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 m6A相關(guān)蛋白在膀胱癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平TCGA數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，在19種m6A相關(guān)蛋白中,甲基化蛋白METTL3、閱讀蛋白IGF2BP1、IGF2BP3和YTHDC1的表達(dá)量在腫瘤組織中顯著高于癌旁組織；而其他甲基化蛋白如METTL14和METTL16，去甲基化蛋白ALKBH5和FTO的表達(dá)在腫瘤組織中則顯著下調(diào)(P<0.05，圖1A)。同時(shí)，在膀胱癌中，m6A相關(guān)蛋白之間存在不同程度的相關(guān)性。其中IGF2BP1與METTL3、IGF2BP2、IGF2BP3和YTHDC1等呈現(xiàn)不同強(qiáng)度的正相關(guān)性(圖1B),提示IGF2BP1可能通過(guò)m6A依賴的方式與其他m6A相關(guān)蛋白協(xié)調(diào)作用發(fā)揮致癌作用。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/)聯(lián)合GTEx中的正常組織樣本和TCGA中的臨床樣本綜合分析顯示：IGF2BP1在膀胱腫瘤中高表達(dá)(圖1C)。

A：19種m6A相關(guān)蛋白在TCGA膀胱癌樣本中的差異表達(dá);B：STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析19種m6A相關(guān)蛋白的相關(guān)性;C：GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示IGF2BP1在膀胱癌中的高表達(dá)。圖1 m6A相關(guān)蛋白在膀胱癌中的表達(dá)

2.2 IGF2BP1在膀胱癌組織及人膀胱癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平在35例膀胱癌患者的臨床樣本中，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示膀胱腫瘤組織中IGF2BP1的mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織(P=0.048 1,圖2A)，與公共數(shù)據(jù)庫(kù)TCGA分析結(jié)果一致。免疫組化檢測(cè)表明，IGF2BP1的蛋白表達(dá)水平在腫瘤組織中也顯著高于癌旁組織(圖2B)。隨后我們以人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC細(xì)胞為對(duì)照組細(xì)胞，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)人膀胱癌細(xì)胞系中IGF2BP1的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在T24、J82和TCC細(xì)胞株中，IGF2BP1的mRNA表達(dá)均明顯高于其在SV-HUC細(xì)胞中的表達(dá)；但在BIU87膀胱癌細(xì)胞中，IGF2BP1表達(dá)差異不明顯(圖2C)。BIU87細(xì)胞屬于低度惡性膀胱癌細(xì)胞，而T24、J82和TCC細(xì)胞則是高度惡性膀胱癌細(xì)胞，IGF2BP1的表達(dá)是否與腫瘤的惡性程度相關(guān)，有待后續(xù)研究驗(yàn)證。

A:qRT-PCR檢測(cè)35對(duì)膀胱癌組織(T)與相鄰癌旁組織(N)中IGF2BP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平；B:免疫組化檢測(cè)顯示IGF2BP1蛋白在膀胱癌臨床樣本中的表達(dá)情況(×200，×400)；C:以SV-HUC細(xì)胞為對(duì)照，qRT-PCR檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞系中的IGF2BP1的相對(duì)表達(dá)水平(*P<0.05,**P<0.01，NS表示數(shù)據(jù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)；D:生存分析顯示IGF2BP1表達(dá)水平對(duì)35例膀胱癌患者預(yù)后的影響。圖2 IGF2BP1在膀胱癌臨床樣本中表達(dá)升高并影響膀胱癌患者預(yù)后

2.3 IGF2BP1表達(dá)與膀胱癌患者病理特征的相關(guān)性分析在本研究中，IGF2BP1的mRNA表達(dá)與膀胱癌患者的年齡、性別、腫瘤分期、分級(jí)和腫瘤最大徑之間均無(wú)明顯關(guān)聯(lián)(P>0.05，表1)，可能是本研究中臨床樣本例數(shù)過(guò)少導(dǎo)致。但是Kaplan-Meier生存分析顯示，與低表達(dá)IGF2BP1的膀胱癌患者相比，高表達(dá)IGF2BP1的患者預(yù)后更差，生存時(shí)間更短(P=0.030 2，圖2D)。

表1 IGF2BP1 mRNA的表達(dá)與膀胱癌患者病理特征的相關(guān)性分析

2.4 IGF2BP1 siRNA轉(zhuǎn)染效果及其對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖能力的影響T24細(xì)胞轉(zhuǎn)染IGF2BP1 siRNA 48 h后，通過(guò)qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)各組細(xì)胞IGF2BP1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，相比于NC組，siRNA組IGF2BP1的表達(dá)明顯降低(圖3A、B)。隨后使用轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，IGF2BP1基因干擾后導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力顯著下降(圖3C)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)檢測(cè)也顯示，IGF2BP1基因干擾降低了菌落形成效率(圖3D)。

A～B：qRT-PCR和western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IGF2BP1小干擾RNA的轉(zhuǎn)染效率；C～D：CCK8實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IGF2BP1干擾后膀胱癌細(xì)胞的增殖能力。結(jié)晶紫染色；*P<0.05,**P<0.01。圖3 IGF2BP1干擾后膀胱癌細(xì)胞增殖能力減弱

3 討 論

m6A甲基化蛋白和去甲基化蛋白之間的交互作用決定了m6A修飾的動(dòng)態(tài)過(guò)程和可逆調(diào)節(jié)。然而，m6A修飾必須被不同的閱讀蛋白所識(shí)別才能發(fā)揮不同的下游功能[11]。閱讀蛋白IGF2BP1在胚胎發(fā)育過(guò)程中大量存在，在成年時(shí)幾乎看不到，但在癌癥發(fā)生時(shí)IGF2BP1又重新合成進(jìn)而表達(dá)上調(diào)[12]。既往研究發(fā)現(xiàn)IGF2BP1可通過(guò)內(nèi)切酶干擾目標(biāo)mRNA的降解發(fā)揮致癌作用；最近的研究發(fā)現(xiàn)IGF2BP1優(yōu)先識(shí)別發(fā)生m6A修飾的mRNA，其與靶基因的關(guān)聯(lián)也可以通過(guò)識(shí)別靶轉(zhuǎn)錄本的m6A修飾而增強(qiáng)，表明IGF2BP1是一種新的m6A解讀器[8]。2020年最新研究表明，作為m6A修飾的閱讀蛋白，IGF2BP1可以通過(guò)識(shí)別m6A修飾進(jìn)而縮短多種癌細(xì)胞的G1期細(xì)胞周期[13]；LINC00266-1編碼的多肽RBRP可以增強(qiáng)IGF2BP1對(duì)靶基因的m6A修飾的識(shí)別，從而發(fā)揮致癌功能[7]。

在過(guò)去的40多年里，肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌和晚期膀胱癌的系統(tǒng)治療主要以鉑類的化療為主。然而在近10年，測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使得膀胱癌的基因組特性得以快速確定，加深了我們對(duì)膀胱癌發(fā)病機(jī)制的理解，膀胱癌治療前景也相應(yīng)地發(fā)生了一些變化：常用的分子靶點(diǎn)被用于開(kāi)發(fā)靶向療法，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體抑制劑和抗體-藥物偶聯(lián)療法[14]。而m6A修飾研究的迅速發(fā)展也標(biāo)志著分子生物學(xué)的重大進(jìn)展，有助于揭示癌癥發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制，可能為癌癥治療提供新的靶點(diǎn)。目前多項(xiàng)研究表明甲基化蛋白METTL3寫(xiě)入m6A修飾后可以促進(jìn)膀胱癌進(jìn)展[10,15-16]；METTL14介導(dǎo)Notch1發(fā)生m6A修飾卻可以抑制Notch1自身RNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而抑制膀胱癌干細(xì)胞的自我更新與膀胱腫瘤的發(fā)生[17]，其他關(guān)于m6A修飾在膀胱癌中的研究相對(duì)較少。

本研究通過(guò)siRNA技術(shù)干擾膀胱癌細(xì)胞IGF2BP1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF2BP1表達(dá)抑制后膀胱癌細(xì)胞增殖活力明顯降低，提示抑制IGF2BP1表達(dá)可減緩膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，IGF2BP1在膀胱癌組織和膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)均明顯上調(diào)，與公共數(shù)據(jù)庫(kù)TCGA的分析結(jié)果一致，提示IGF2BP1的高表達(dá)可能與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)，有可能會(huì)成為膀胱癌治療中新的治療靶點(diǎn)，但是由于本研究臨床樣本太少，IGF2BP1 mRNA的表達(dá)與患者的病理特征均無(wú)明顯關(guān)系，后續(xù)還需要大量的臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。下一步本課題組將重點(diǎn)研究IGF2BP1基因表達(dá)影響膀胱癌進(jìn)展的具體機(jī)制，并且探討針對(duì)性靶向基因治療是否具有臨床應(yīng)用的研究前景。