黃 鋼，熊琦婕，張英潔，周俊飛，陳利紅

(江漢大學(xué) 系統(tǒng)生物學(xué)研究院，湖北 武漢 430056)

二穗短柄草 (Brachypodiumdistachyon) 屬于禾本科，早熟禾亞科，一年生的溫帶禾本科植物，其植株矮小(5～50 cm)、生活期短 (一般為70 d左右)、自花授粉、繁殖能力強(qiáng)、要求的生活條件簡單且易轉(zhuǎn)化、基因組小、遺傳資源豐富[1]。與擬南芥相比，二穗短柄草與很多重要的禾谷類作物如小麥、大麥、玉米、水稻、高粱等有更近的親緣關(guān)系，是溫帶禾本科植物功能基因組學(xué)研究的理想模式植物。而與水稻相比，二穗短柄草與麥類作物(如六倍體作物小麥)的親緣關(guān)系更近，因此，利用二穗短柄草來研究作物基因的表達(dá)模式和作用機(jī)制，將極大地加速麥類作物功能基因組學(xué)的研究[2]，為麥類作物的分子育種提供一定的幫助。

隨著人類社會的快速發(fā)展，人口數(shù)量急劇增加，生態(tài)環(huán)境日益惡化。這些惡劣的環(huán)境對植物的生長發(fā)育、生理生化等多種代謝途徑造成了嚴(yán)重影響，甚至?xí)斐勺魑锏拇竺娣e減產(chǎn)乃至絕收。植物中的AP2/EREBP 轉(zhuǎn)錄因子超家族，在植物生長發(fā)育[3-4]以及逆境應(yīng)答[5-8]通路中扮演著極其重要的角色。其中的DREB轉(zhuǎn)錄因子，屬于AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子超家族中的CBF/DREB 亞家族，在植物抗冷、干旱、鹽等逆境脅迫起著重要作用。因此，對二穗短柄草中的DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與表達(dá)分析，將為其后續(xù)功能的進(jìn)一步研究打下一定的基礎(chǔ)。

第一個 AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子是在1994年從擬南芥中分離并鑒定出來的，它主要調(diào)控花的發(fā)育過程[9]。在擬南芥中CBF/DREB蛋白與其他AP2/ERF蛋白的區(qū)別在于，CBF/DREB蛋白的AP2結(jié)構(gòu)域兩側(cè)存在一組保守的CBF/DREB特征序列即PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR域。植物CBF/DREB家族中的成員在轉(zhuǎn)基因側(cè)金盞花[6]、短柄草[10]和玉米[11]植株中能有效地提高轉(zhuǎn)基因植物的抗凍性。目前已從大麥[12]、水稻[13]、小麥[14]等單子葉植物和擬南芥[15]、大豆[16]、煙草[17]、棉花[18]等雙子葉植物中分離和鑒定出大量DERB轉(zhuǎn)錄因子。而在二穗短柄草中的研究報道卻較少，本研究利用RT-PCR方法從二穗短柄草中克隆了一個BdDREB1H基因，然后探索了其在根、莖、葉3種組織的表達(dá)模式，最后比較了它在冷(4 ℃)、干旱(PEG)、鹽(NaCl)和氧化(H2O2)4種非生物脅迫處理下的表達(dá)模式，為在二穗短柄草乃至整個禾本科的DREB蛋白的功能研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

二穗短柄草BD21、酵母菌株AH109為江漢大學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)研究院保存。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a和Trans1-T1、pEASY-Blunt Cloning Vector、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量(SYBR Green)PCR 試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；膠回收試劑盒、Marker 和質(zhì)粒提取試劑盒購于天根生化科技有限公司；酵母SD培養(yǎng)基及其他相關(guān)培養(yǎng)基購自Clontech生物公司；PrimeSTAR 高保真酶、限制性內(nèi)切酶和T4DNA 連接酶購于TaKaRa公司；引物合成與測序均在蘇州金唯智完成(表1)。

表1 引物序列和注釋Tab.1 Primer sequence and its annotation

1.2 總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成

挑選飽滿的二穗短柄草種子，剝?nèi)ケ砥げシN在潤濕的3～4層紗布上，25 ℃培養(yǎng)。定期觀察，補充水分，以保持紗布濕潤。14～21 d后取生長狀態(tài)良好的二穗短柄草整株幼苗，用TRIzol試劑提取二穗短柄草的總RNA，然后利用南京諾唯贊生物科技有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

1.3 BdDREB1H基因的克隆

根據(jù)二穗短柄草DREB1H基因(GenBank accession：XM_010240091.3)的核酸序列，用Prime 5軟件設(shè)計用于該基因克隆的特異性引物(表1)。以得到的cDNA為模板，CB1F1/CB1R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收735 bp的目標(biāo)片段，目標(biāo)片段連接到T載體(pEASY-Blunt Cloning Vector)上，然后再轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)DH5a中進(jìn)行菌液PCR和測序檢測。提取測序正確菌株的質(zhì)粒，進(jìn)而獲得BdDREB1H基因的全長讀碼框序列。

1.4 BdDREB1H基因生物信息學(xué)分析

利用DNAStar軟件對測序得到的BdDREB1H核酸序列進(jìn)行開放閱讀框分析；利用在線分析工具ExPaSy-ProtParam (https：//web.expasy.org/protparam/)對BdDREB1H蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測；利用SOPMA(http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和phyre2(sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)分別對BdDREB1H蛋白的二級結(jié)構(gòu)和3D模型進(jìn)行預(yù)測；利用MUSCLE進(jìn)行多序列比對(http：//www.drive5.com/muscle/manual/)并利用MEGA 7(https：//www.megasoftware.net/) 進(jìn)行進(jìn)化分析。

1.5 BdDREB1H基因轉(zhuǎn)錄激活活性鑒定

以測序正確的含有BdDREB1H基因的T載體質(zhì)粒為模板，以表1中CBF1SB和CBF1RB引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后同BdDREB1H基因克隆的過程類似，進(jìn)行目的片段的回收、連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、陽性克隆子鑒定與測序，測序正確的質(zhì)粒命名為DREB1H-T。然后分別對DREB1H-T質(zhì)粒和酵母pGBKT7載體進(jìn)行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切、目標(biāo)片段回收、連接、轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，PCR和酶切檢測后，陽性菌液送往蘇州金唯智測序并提取質(zhì)粒。測序成功的質(zhì)粒即為用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄激活活性分析的酵母重組表達(dá)載體DREB1H-BD。隨后將DREB1H-BD、BD 空載(pGBKT7，陰性對照質(zhì)粒)分別轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109 感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于缺陷培養(yǎng)基SD/-Trp 上。30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d 后，挑取單克隆菌落，活化后分別涂布于酵母SD/His-和SD/His-+X-α-gal 培養(yǎng)基上。30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d 后觀察菌落生長和顯色情況并拍照。

1.6 BdDREB1H基因表達(dá)分析

根據(jù)測序得到的BdDREB1H基因序列，通過Prime 5軟件設(shè)計內(nèi)參基因引物和Real-time PCR引物(表1)。挑選飽滿的二穗短柄草種子，剝?nèi)ケ砥げシN在潤濕的3～4層紗布上，25 ℃培養(yǎng)。定期觀察，補充水分，以保持紗布濕潤。14～21 d后取生長狀態(tài)良好的二穗短柄草整株幼苗，一部分不做處理，分別提取根、莖和葉的RNA用于后續(xù)組織表達(dá)分析；其余的幼苗分別用300 mmol/L NaCl(鹽處理)、300 mmol/L 甘露醇(模擬干旱處理)、10 μmol/L H2O2(氧化處理)和4 ℃(冷處理)處理0，1，2，5，24 h，然后分別提取其總RNA，按照南京諾唯贊生物科技有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄后采用諾唯贊生物科技有限公司SYBR熒光qPCR試劑盒對BdDREB1H進(jìn)行表達(dá)量檢測，特異性引物和內(nèi)參BdUBC18基因引物見表1。qPCR反應(yīng)在本研究院的CFX96(Bio-Rad)機(jī)器中進(jìn)行，每個反應(yīng)設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，程序如下：預(yù)變性95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。得到的數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行表達(dá)分析，同時利用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 BdDREB1H基因的克隆

以表1中CB1F1和CB1R1引物對反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并利用1%的瓊脂糖凝膠對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，擴(kuò)增出一條750 bp左右的目的片段(圖1-A)，獲得與預(yù)期試驗結(jié)果一致的目標(biāo)片段(735 bp)。將目的條帶連接到T載體上，測序結(jié)果表明，所克隆的基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的DREB1H基因(GenBank accession：XM_010240091.3)的序列一致。

2.2 BdDREB1H基因生物信息學(xué)分析

獲得的BdDREB1H基因編碼框為735 bp，共編碼244個氨基酸，含有一個由 74 氨基酸組成的保守的 AP2 結(jié)構(gòu)域。理化性質(zhì)預(yù)測分析表明：BdDREB1H蛋白含量排前三的氨基酸分別為Ala占16.0%、Pro占9.0%、Arg占7.8%；帶負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)(Asp+Glu)：29，帶正電荷氨基酸殘基總數(shù)(Arg+Lys)：23；分子式：C1156H1777O345S15，分子量：26.34 ku，等電點(PI)5.63；不穩(wěn)定指數(shù)(Ⅱ)計算為64.17，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；總親水平均值為-0.261，為親水蛋白。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測：二級結(jié)果預(yù)測顯示BdDREB1H蛋白質(zhì)含有29.51%的α-螺旋、9.84%的β-折疊和59.84%無規(guī)則卷曲。對BdDREB1H蛋白進(jìn)行3D模型預(yù)測，結(jié)果如圖1-B，覆蓋了BdDREB1H蛋白質(zhì)序列的第44-118位的氨基酸片段，占整個預(yù)測片段的30%，為AP2-ERF保守區(qū)。

氨基酸序列比對及進(jìn)化分析：利用MUSCLE (http：//www.drive5.com/muscle/)和 MEGA 7 將二穗短柄草DREB1H(XP_010238393.1)的氨基酸序列同黑麥草CBF(Loliumperenne， BAF36841.1)、普通小麥CBF(Triticumaestivum，AFR67799.1)、硬粒小麥CBF(Triticumturgidumsubsp. Durum，VAI34800.1)、燕麥CBF(Avenasativa，CAJ21277.1)、普通小麥CBFⅢd-A19 (Triticumaestivum，AEE00133.1)、兩芒山羊草CBF5(Aegilopsbiuncialis，CBX87019.1)、粗山羊草DREB1H-like(Aegilopstauschiisubsp. Tauschii，XP_020167751.1)、大麥HvCBF10A (Hordeumvulgare，AAX23710.1)、黑麥CBFⅢc-10 (Secalecereale， ABY59780.1)9個禾本科植物的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對和進(jìn)化分析。多序列比對結(jié)果顯示，這10個禾本科作物的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域高度保守(圖2)；且二穗短柄草DREB1H的氨基酸序列與普通小麥CBF、黑麥草CBF、和普通小麥的氨基酸序列具有更高的同源性，同源性分別為64.44%，63.36%,61.54%。進(jìn)化分析表明,這10個CBF/DEREB蛋白可聚為兩大支(圖3)，其中二穗短柄草DREB1H與普通小麥CBF、黑麥草CBF、燕麥CBF、普通小麥CBFⅢd-A19、兩芒山羊草CBF5和DREB1H-like聚為一支(Group 1)，硬粒小麥CBF、大麥HvCBF和黑麥CBF聚為一支(Group 2)。相對于Group 2的CBF成員，二穗短柄草DREB1H與Group 1中的CBF成員親緣關(guān)系更近些。

2.3 BdDREB1H基因的轉(zhuǎn)錄激活分析

為了研究BdDREB1H基因是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性，將BdDREB1H構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pGBKT7(BD)上，構(gòu)建成功的載體命名為DREB1H-BD。隨后將DREB1H-BD、BD 空載體(pGBKT7，陰性對照質(zhì)粒)分別轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中(圖4)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)DREB1H-BD和BD 空載的酵母菌均能在色氨酸缺陷型SD培養(yǎng)基上正常生長，表明這2個載體均已轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中。轉(zhuǎn)DREB1H-BD的酵母菌能夠在組氨酸缺陷型SD培養(yǎng)基上生長良好，而轉(zhuǎn)BD 空載的陰性對照的酵母卻不能生長；并且DREB1H-BD酵母菌能在添加X-α-gal組氨酸缺陷型SD培養(yǎng)基上顯藍(lán)色，表明轉(zhuǎn)入DREB1H-BD的酵母菌中的報告基因His和LacZ被激活。這些結(jié)果表明，BdDREB1H蛋白具有明顯的轉(zhuǎn)錄激活活性。

2.4 BdDREB1H基因表達(dá)分析

以BdUBC18為內(nèi)參基因，利用內(nèi)參引物BdUBC18-F/BdUBC18-R和BdDREB1H基因的特異引物qCB1F/qCB1R，對BdDREB1H基因在二穗短柄草根、莖和葉3種組織中的表達(dá)量進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，BdDREB1H在根、莖和葉中均有表達(dá)(圖5-A)，其中在莖中表達(dá)最高，葉中表達(dá)量最低。

此外，對二穗短柄草在300 mmol/L 甘露醇(模擬干旱處理)、300 mmol/L NaCl(鹽處理)、10 μmol/L H2O2(氧化處理)和4 ℃(冷處理)這4種常見逆境脅迫條件下的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)果表明冷處理后，BdDREB1H的轉(zhuǎn)錄水平先升高，在2 h達(dá)到最高，是對照的6倍，然后隨時間的延長而下降(圖5-B)。干旱和氧化處理條件下，BdDREB1H在2 h后轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對照(圖5-C、D)；而鹽脅迫處理條件下，BdDREB1H在處理1 h，表達(dá)水平基本無變化，而在2 h后，表達(dá)水平顯著低于對照(圖5-E)。

3 討論

作物生長過程中的非生物脅迫，如干旱、高鹽和溫度波動等嚴(yán)重影響著作物的生長與發(fā)育，輕則導(dǎo)致作物生產(chǎn)力下降或減產(chǎn)，重則甚至?xí)?dǎo)致重大的經(jīng)濟(jì)損失[19]。研究表明，AP2/EREBP家族成員多、數(shù)目龐大，參與調(diào)控植物細(xì)胞周期、生長發(fā)育和環(huán)境脅迫等一系列應(yīng)答過程；它們都含有一個由 60 個左右的氨基酸殘基組成的DNA結(jié)合區(qū)，即AP2/EREBP結(jié)合域，在不同的植物中非常保守[20]。其中DREB屬于AP2/EREBP超家族的DREB/CBF亞家族。該亞家族主要包括抗冷的DREB1/CBF和抗干旱/鹽的DREB2 2個小類[20]。

研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)擬南芥DREB1B的轉(zhuǎn)基因丹參增加了對干旱的耐受性但不阻礙其生長[5]。耐寒植物側(cè)金盞花中的AaDREB1轉(zhuǎn)錄因子可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因生物對多種非生物脅迫的耐受性[6]。但在擬南芥中過表達(dá)DREB基因雖然提高了擬南芥的抗性，但同時卻帶來了新的問題，如發(fā)育畸形、生長矮化、遲緩等[21]，這些研究表明，DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)基因植物中的調(diào)控機(jī)制是復(fù)雜的，所以對DREB基因的深入研究和克隆新的DREB基因是有必要的。此外，目前已有的關(guān)于DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子的功能驗證主要還是集中在模式植物擬南芥中，對于其他植物的研究少之又少[21]。其中短柄草中DREB基因的相關(guān)研究報道更少。

本研究以此為切入點，從二穗短柄草中克隆了一個BdDREB1H轉(zhuǎn)錄因子基因，序列分析表明其編碼框為735 bp，編碼244個氨基酸。多序列比對和結(jié)構(gòu)域分析表明，BdDREB1H蛋白含有典型的AP2結(jié)構(gòu)域，屬于AP2/EREBP超家族中的DREB/CBF家族。進(jìn)化分析表明，BdDREB1H 轉(zhuǎn)錄因子與普通小麥的CBF同源性最高，其次為黑麥草。此外還發(fā)現(xiàn)它編碼的氨基酸在保守區(qū)與其他物種序列同源性非常高，而在非保守區(qū)序列變異較大。這種氨基酸組成詮釋了DREB/CBF家族成員對靶序列結(jié)合的專一性及轉(zhuǎn)錄激活功能的多樣性。進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄活性分析顯示BdDREB1H 轉(zhuǎn)錄因子具有明顯的轉(zhuǎn)錄激活活性。

前人的研究表明，DREB/CBF 家族成員在正常生長條件下，幾乎不表達(dá)，而在冷、干旱、鹽等生物脅迫條件下，表達(dá)量變化顯著。如水稻DREB1/CBF轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控冷信號通路[13]；過表達(dá)擬南芥DREB1B的丹參提高了植物的耐旱性[5]。異源表達(dá)補血草LbDREB提高了植物的耐鹽性[22]。本研究通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，BdDREB1H基因在不同組織中表達(dá)量有顯著的差異，其中在根和莖中表達(dá)量相對較高。冷處理條件2 h，相對于對照，轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了6倍，然后隨著處理時間的延長，轉(zhuǎn)錄水平逐漸下降。干旱和氧化脅迫2 h后，BdDREB1H表達(dá)水平顯著高于對照組；與之相反，在鹽脅迫2 h 后，BdDREB1H轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。因此，推測其在二穗短柄草應(yīng)對非生物脅迫過程中可能發(fā)揮著重要作用。

總之，本研究通過對二穗短柄草BdDREB1H轉(zhuǎn)錄因子的克隆、生物信息學(xué)分析、表達(dá)分析以及轉(zhuǎn)錄激活活性等的分析，加深了對BdDREB1H的認(rèn)識，豐富了植物抗性相關(guān)基因的研究內(nèi)容，為提高麥類、牧草、草坪草等禾本科植物的抗逆分子機(jī)制提供了新的研究思路和材料。