孔宏亮，趙雨婷，蔣玉昆

［1.遼寧省人民醫(yī)院（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院）心臟中心，沈陽(yáng) 110013；2.大連醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧大連 116023］

在方劑“君臣佐使”配伍中居“君”位的人參廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療，其重要成分人參皂甙Rbl（ginsenosides-Rbl，Gs-Rbl）可顯著改善心肌細(xì)胞耐缺氧能力和心力衰竭等［1-7］，其機(jī)制主要與改善心肌重構(gòu)、減輕心肌細(xì)胞凋亡和自噬、改善心肌代謝、調(diào)節(jié)肌質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和抗炎等有關(guān)［1-9］。心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+（intracellular calcium，iCa2+）濃度變化是細(xì)胞生理功能的重要基礎(chǔ)，所有這些決定于Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)攝取和釋放等，iCa2+循環(huán)失調(diào)是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的重要特征［10-14］。肌質(zhì)網(wǎng)和線粒體等細(xì)胞器的Ca2+穩(wěn)態(tài)對(duì)維持心肌iCa2+循環(huán)起著十分重要的作用［10-14］，其中線粒體Ca2+（mitochondrial calcium，mCa2+）既有效調(diào)節(jié)心肌iCa2+穩(wěn)態(tài)又高效調(diào)節(jié)線粒體“呼吸”功能及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)等，從而維持心肌細(xì)胞功能的高效性［10-14］，心力衰竭可促發(fā)mCa2+超載和失衡并因此加重心力衰竭［10］，改善mCa2+超載和失衡即可有效減輕心力衰竭［10］。Gs-Rbl 可通過(guò)抑制缺氧心肌細(xì)胞線粒體通透轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的開放而改善心肌細(xì)胞的耐缺氧能力［9］，而mPTP 介導(dǎo)mCa2+穩(wěn)態(tài)［10-14］。當(dāng)前“強(qiáng)心”藥物主要通過(guò)心肌iCa2+和（或）增加心肌收縮蛋白對(duì)iCa2+的敏感性提高心肌收縮力，但具有“多靶點(diǎn)”效應(yīng)的Gs-Rbl 是否通過(guò)調(diào)節(jié)iCa2+等改善心功能并不清楚。

1 材料和方法

1.1 材料及儀器

動(dòng)物：雄性Wistar 大鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心［SCXK（遼）2015-0009］，體質(zhì)量150～200 g。試劑：阿霉素購(gòu)自Sigma 公司，Gs-Rbl（純度96%）購(gòu)自中科院昆明植物研究所，氨基末端腦鈉肽前體（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自Invitrogen 公司。儀器包括二維心臟超聲（Ving?med CFM-725，7.5 MHz broadband transducer，USA），低溫離心機(jī)（Hitachi），低溫超速離心機(jī)（2K15C 型，Sigma），激光掃描共聚焦顯微鏡（CellInsight CX7 LZR，Thermo fisher scientific Inc），熒光分光光度計(jì)（日立F-7000），F(xiàn)luo-3/AM（Invitrogen）、Fluo-5N/AM（Invitrogen）、Fura-FF（Invitrogen）和JC-1（Enzo Life Sciences）等。

1.2 心力衰竭大鼠模型構(gòu)建方法

按以前的方法成功構(gòu)建大鼠心力衰竭模型［3］：根據(jù)大鼠體質(zhì)量腹腔內(nèi)注射阿霉素，每3日1次，每次2 mg/kg，連續(xù)5 次；之后每周1 次，每次2 mg/kg，共5 次。在最后干預(yù)2 周后，對(duì)大鼠行心臟超聲檢查確認(rèn)成模，之后隨機(jī)分為心力衰竭組（n=16）和Gs-Rb1 組（n=18），同時(shí)隨機(jī)選同齡健康大鼠腹腔內(nèi)注射等量0.9%氯化鈉溶液（按阿霉素注射方法）作為對(duì)照組（n=10）。除Gs-Rb1 組飲食中添加Gs-Rbl［70 mg/（kg·d），1 日3 次］外，其他所有大鼠均常規(guī)喂養(yǎng)。4 周后大鼠均行心臟超聲檢查。

1.3 心臟超聲檢查方法

按下述方法行二維心臟超聲檢查［3］：腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（0.3～0.4 mg/l00 g 體質(zhì)量），麻醉后（15～20 min）仰臥位固定，心臟超聲評(píng)價(jià)心功能，間斷3 次測(cè)定相關(guān)指標(biāo)取其均值獲得左心室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）和左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）：LVEF=（左心室舒張末橫截面積-左心室收縮末橫截面積）/左心室舒張末橫截面積，LVFS=（左心室舒張末內(nèi)徑-左心室收縮末內(nèi)徑）/左心室舒張末內(nèi)徑。LVEF<45%被作為左心衰竭標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定氨基末端腦鈉肽前體濃度

根據(jù)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)各組大鼠的NT-pro-BNP 濃度。

1.5 心肌細(xì)胞分離方法

每組各取5 只大鼠肝素化分離心肌細(xì)胞，其他大鼠取全血后分離、提取左心室，-80 ℃保存準(zhǔn)備后續(xù)檢測(cè)。采用酶解法分離心室肌細(xì)胞［17］：將肝素化大鼠迅速開胸取心，用4℃無(wú)鈣臺(tái)式液清洗、剪除脂肪組織、修剪主動(dòng)脈長(zhǎng)度并行主動(dòng)脈插管，于Lan?gendorff 裝置下逆行灌流（37℃，流速6～7 mL/min，100%氧飽和）。無(wú)鈣臺(tái)式液灌流7～8 min 后，以含Ca2+（60 μmol/L）的Ⅱ型膠原酶（0.6 mg/mL）臺(tái)氏液灌流，8～10 min 后剪下心室部，于Kraft-Bruhe（KB，37 ℃）液中剪碎心室肌，緩慢吹打1 min 后用200 目尼龍網(wǎng)過(guò)濾、室溫下沉淀10～15 min，取沉淀液復(fù)鈣；每次復(fù)鈣10 min，先后加入復(fù)鈣液A、復(fù)鈣液B、復(fù)鈣液C 和復(fù)鈣液D，將細(xì)胞外液鈣濃度逐步復(fù)鈣為1.2 mmol/L；棄上清液并加入KB 液室溫靜置1～2 h 備用。

1.6 鈣熒光染色方法

鈣熒光指示劑Fluo-3/AM、Fluo-5N/AM 分別溶解于二甲基亞砜（DMSO），終濃度均為10 μmol/L。取各組心肌細(xì)胞分別于Fluo-3/AM 溶液（室溫孵育30 min，KB 液漂洗3 次，每次5 min）、Fluo-5N/AM（37 ℃孵育2.5 h，KB液漂洗3次，每次5 min）在避光條件下孵育。然后在37℃溫箱中靜置1.5 h后備用。

1.7 鈣瞬變記錄

室溫（20℃～22℃）下，將孵育好熒光染料Fluo-3/AM 的細(xì)胞置于含細(xì)胞外液的細(xì)胞池中，同時(shí)應(yīng)用5 mmol/L氯化鎳和100 nmol/L毒胡蘿卜素分別阻斷心肌細(xì)胞鈉鈣交換蛋白（sodium-calcium exchanger，NCX）和肌漿網(wǎng)鈣泵（sarcoplasmic reticulum calci?um adenodine triphosphatase，SERCA2a），用激光掃描共聚焦顯微鏡記錄單個(gè)心肌細(xì)胞的鈣誘導(dǎo)鈣瞬變，包括動(dòng)作電位誘導(dǎo)的鈣瞬變（即鈣火花頻率，以細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度表示）和鈣瞬變峰值（以ΔF/F0 表示）。物鏡為40 倍油鏡，數(shù)值孔徑為1.25；激發(fā)光波長(zhǎng)為-488 nm，在波長(zhǎng)-500～560 nm 收集發(fā)射波長(zhǎng)。共聚焦顯微鏡成像采用線掃描方式（每條線1 024 像素，速率2 ms/線）。二維平面掃描獲得細(xì)胞整體范圍后，調(diào)節(jié)焦平面位置選取合適細(xì)胞層面（即熒光分布均勻且盡可能避開細(xì)胞核所在層面），之后將掃描線置于細(xì)胞長(zhǎng)軸縱向正中切面中央，線掃描方式與局部場(chǎng)刺激配合下記錄胞內(nèi)鈣瞬變。

1.8 肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+濃度檢測(cè)

室溫下，將孵育好熒光染料Fluo-5N/AM 的細(xì)胞置于含細(xì)胞外液的細(xì)胞池中。按上述激光共聚焦掃描顯微鏡參數(shù)，采用面掃描方式記錄心肌細(xì)胞鈣瞬變，其直接表示肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2+濃度（采樣速率20 s/幀），以ΔF/F0 表示。

1.9 熒光分光光度計(jì)檢測(cè)線粒體Ca2+攝取和釋放

提前3 周經(jīng)尾靜脈注射1×1 011 粒AAV6-mi?tycam 粒子，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)按上述方法分離心肌細(xì)胞并即刻檢測(cè)mCa2+攝?。?.1 Hz 起搏），檢測(cè)mCa2+攝取和流出定量前均消除背景熒光評(píng)估。37 °C 下，心肌細(xì)胞（3.0×106）在類似細(xì)胞內(nèi)液培養(yǎng)液中孵育，柔和攪動(dòng)心肌細(xì)胞并添加1 μmol/L Fura-FF 或1 μmol/L JC-1 以便檢測(cè)線粒體內(nèi)外Ca2+。該儀器以激發(fā)波長(zhǎng)490 nm/發(fā)射波長(zhǎng)535 nm 檢測(cè)熒光信號(hào)，以340～380 nm 激發(fā)波長(zhǎng)/510 nm 發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)Fura-FF；350 s 后每隔60 s 添加10 μmol/L Ca2+，線粒體外Ca2+的清除代表mCa2+攝取。以570 nm 激發(fā)波長(zhǎng)/595 nm 發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)JC-1 聚合物，在550 s后加入1 μmol/L Ru360（MCU 抑制劑）以抑制mCa2+攝取和釋放，有助于定量mCa2+釋放。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以（）表示，用One-way 方差（One-way ANOVN）Dunnett′s t3（3）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠左心功能指標(biāo)比較

在本研究過(guò)程中，各組大鼠均沒有死亡。阿霉素干預(yù)可顯著降低大鼠LVFS、LVEF 和升高其血清NT-pro BNP 濃度，而Gs-Rb1 干預(yù)可顯著提高心力衰竭大鼠的LVFS、LVEF 和顯著降低血清NT-pro BNP 濃度，詳見圖1 和表1。

圖1 各組大鼠LVFS 比較

表1 各組大鼠左心功能指標(biāo)比較 ［］

表1 各組大鼠左心功能指標(biāo)比較 ［］

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與心力衰竭組比較，1）**P<0.01

2.2 各組大鼠心肌細(xì)胞鈣火花頻率和鈣瞬變峰值比較

為明確Gs-Rb1 對(duì)心力衰竭大鼠鈣瞬變的影響，本研究在各組大鼠均記錄10 個(gè)心肌細(xì)胞的鈣瞬變，結(jié)果顯示心力衰竭組大鼠動(dòng)作電位過(guò)程中鈣火花頻率和鈣瞬變峰值均顯著低于對(duì)照組，而Gs-Rb1 可顯著提高心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞的鈣火花頻率和鈣瞬變峰值，詳見圖2 和表2。

圖2 各組大鼠動(dòng)作電位誘導(dǎo)的鈣瞬變（上面為各組大鼠的熒光圖，下面為各組大鼠相應(yīng)的的三維立體熒光圖）

表2 各組大鼠鈣火花頻率和鈣瞬變峰值比較 ［］

表2 各組大鼠鈣火花頻率和鈣瞬變峰值比較 ［］

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與心力衰竭組比較，1）**P<0.01

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+濃度比較

為了明確Gs-Rb1 對(duì)心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+濃度的影響，本研究在各組大鼠均記錄10 個(gè)心肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+濃度，結(jié)果顯示心力衰竭組大鼠單個(gè)心肌細(xì)胞Fluo-5N/AM 染色后的熒光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度顯著下降，而Gs-Rb1 可顯著改善心力衰竭大鼠單個(gè)心肌細(xì)胞熒光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度變化，詳見圖3 和表3。

圖3 各組大鼠心肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣瞬變圖像（上面為各組大鼠的熒光圖，中間為各組大鼠相應(yīng)的的三維立體熒光圖，下面為熒光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)演變圖）

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+濃度比較［］

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+濃度比較［］

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與心力衰竭組比較，1）**P<0.01

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞線粒體的Ca2+攝取和釋放比較

為了明確Gs-Rb1 對(duì)心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞線粒體Ca2+攝取和釋放的影響，本研究應(yīng)用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)mCa2+攝取和釋放，結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，心力衰竭組大鼠心肌細(xì)胞線粒體的Ca2+攝取和釋放顯著下降，而Gs-Rb1 可顯著改善心力衰竭大鼠的mCa2+攝取和釋放，詳見表4。

表4 各組大鼠心肌細(xì)胞線粒體的Ca2+攝取和釋放比較［］

表4 各組大鼠心肌細(xì)胞線粒體的Ca2+攝取和釋放比較［］

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與心力衰竭組比較，1）**P<0.01

3 討論

心肌細(xì)胞iCa2+循環(huán)失衡是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)和終端機(jī)制［10］，心肌收縮力和心肌順應(yīng)性決定于心肌iCa2+濃度和（或）心肌收縮蛋白對(duì)iCa2+的敏感性［10-14］。本研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭大鼠動(dòng)作電位過(guò)程中鈣火花頻率和鈣瞬變峰值均顯著降低，提示心肌細(xì)胞的興奮-收縮藕聯(lián)機(jī)制受損，從而導(dǎo)致心肌收縮無(wú)力［11］；Gs-Rb1 干預(yù)的心力衰竭大鼠動(dòng)作電位時(shí)程中的鈣火花頻率和鈣瞬變峰值均可得到改善，提示Gs-Rb1 可能通過(guò)修復(fù)心肌細(xì)胞的興奮-收縮藕聯(lián)機(jī)制提升心肌收縮力；不過(guò)，Gs-Rb1 的這一效應(yīng)并不能使心力衰竭大鼠心功能恢復(fù)到正常大鼠的水平。

心肌細(xì)胞內(nèi)游離iCa2+濃度的變化是心肌興奮-收縮耦聯(lián)等細(xì)胞生理功能的重要基礎(chǔ)，其穩(wěn)態(tài)不僅僅取決于Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，亦取決于心肌細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)對(duì)Ca2+的攝取和釋放等。心肌細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器肌質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的鈣庫(kù)之一，其具有Ca2+釋放、Ca2+回?cái)z及Ca2+儲(chǔ)存三大功能，這些功能是心肌細(xì)胞iCa2+循環(huán)的重要機(jī)制，其功能失調(diào)將損害心肌的收縮功能和舒張功能，即引起心功能失調(diào)［10-14］。在進(jìn)一步證實(shí)心力衰竭時(shí)心肌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度下降外，本研究結(jié)果顯示Gs-Rb1可改善心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞Fluo-5N/AM 染色的熒光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度，即Gs-Rb1 可能通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)的Ca2+濃度改善心臟功能，提示Gs-Rb1 對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)的Ca2+調(diào)節(jié)具有一定功能，但Gs-Rb1 如何調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+穩(wěn)態(tài)卻有待進(jìn)一步研究。

心肌iCa2+循環(huán)亦有賴于線粒體的Ca2+穩(wěn)態(tài)［10-14］，mCa2+在調(diào)節(jié)心肌iCa2+穩(wěn)態(tài)的同時(shí)亦高效調(diào)節(jié)線粒體“呼吸”功能和細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)系統(tǒng)等［14］。心力衰竭常伴發(fā)mCa2+超載和失衡從而使病情惡化，改善mCa2+超載和失衡即可有效減輕心力衰竭的癥狀［12-13］。本研究證實(shí)Gs-Rb1 可改善心力衰竭時(shí)的mCa2+攝取和釋放功能，提示Gs-Rb1 可減輕心力衰竭狀態(tài)下的mCa2+超載，說(shuō)明Gs-Rb1 除可能通過(guò)線粒體調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度外，尚可能調(diào)節(jié)線粒體功能［9］，二者均是心臟功能完整性的必要調(diào)節(jié)。本研究并未涉及Gs-Rb1如何介導(dǎo)線粒體的Ca2+攝取和釋放功能，此亟待進(jìn)一步研究。

綜上所述，Gs-Rb1 可能通過(guò)調(diào)控心肌細(xì)胞、肌質(zhì)網(wǎng)和線粒體等的Ca2+“交流”等改善心力衰竭。Gs-Rb1 改善心力衰竭時(shí)心肌細(xì)胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)的Ca2+濃度和線粒體的Ca2+穩(wěn)態(tài)可能與心肌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+穩(wěn)態(tài)息息相關(guān)，其更確切的機(jī)制亟待進(jìn)一步研究。