汪曉莎 榮蓓 楊柳 張世杰 李駿

經(jīng)結(jié)膜免縫合微創(chuàng)玻璃體切除術(shù)(transconjunctival sutureless vitrectomy, TSV)在眼科臨床應(yīng)用近二十年[1]，與傳統(tǒng)經(jīng)睫狀體平坦部玻璃體切除術(shù)(parsplana vitrectomy,PPV)相比，不需要行環(huán)結(jié)膜切開，手術(shù)創(chuàng)傷減小、術(shù)后炎癥反應(yīng)較輕[2，3]，已經(jīng)成為目前治療各種玻璃體視網(wǎng)膜疾病的首選手術(shù)方式。隨著手術(shù)的微創(chuàng)化、精細(xì)化，其手術(shù)適應(yīng)證也在逐漸擴(kuò)大[4-8]。雖然手術(shù)成功率和患者術(shù)后視力逐步提高，但是隨著接受手術(shù)患者基數(shù)的增加和人們對生活質(zhì)量要求的提高，患者術(shù)后出現(xiàn)干眼或干眼加重的問題逐漸顯現(xiàn)。

大量研究表明，不同類型眼科手術(shù)均會影響眼表功能，造成術(shù)后干眼或原有干眼癥狀加重[9-12]。其中多數(shù)手術(shù)后的干眼問題已經(jīng)得到充分重視，針對其術(shù)后眼表功能改變、發(fā)生機(jī)制、治療和管理措施等問題的研究已經(jīng)相對充分[13，14]。然而針對TSV術(shù)后眼表功能變化的研究卻相對較少，尤其缺乏長期的、系統(tǒng)的對患者術(shù)后瞼板腺功能和結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度變化的研究。

本研究旨在觀察25G TSV術(shù)后患者干眼癥狀、淚膜穩(wěn)定性、瞼板腺功能和結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度的動態(tài)變化趨勢，并初步探討造成25G TSV術(shù)后患者眼表功能改變的可能原因，以期為臨床預(yù)防和治療25G TSV術(shù)后干眼問題提供新思路。

資料與方法

一、 研究對象

前瞻性、觀察性研究。收集2019年6～9月因各種玻璃體視網(wǎng)膜疾病于北京大學(xué)第一醫(yī)院眼科行25G TSV的患者。

入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲；男性或非妊娠期女性。

排除標(biāo)準(zhǔn)：持續(xù)使用任何眼部局部用藥；佩戴角膜接觸鏡；近6個月內(nèi)有以下任何眼部病史：眼部感染、眼部過敏及免疫疾病；近6個月內(nèi)有任何眼部手術(shù)史、眼部外傷史；需要做環(huán)結(jié)膜切開，如行鞏膜扣帶術(shù)、人工晶狀體懸吊術(shù)等；需要聯(lián)合其他手術(shù)；使用任何與手術(shù)無關(guān)局部或全身藥物的患者需在入組前兩周中止用藥(洗脫期)。

本研究通過了北京大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會的倫理審核，符合赫爾辛基宣言，受檢者均簽署了知情同意書。

二、 手術(shù)與隨訪

所有患者的玻璃體切除術(shù)均由3位資深玻璃體視網(wǎng)膜專家完成。術(shù)前備術(shù)眼，沖洗淚道，術(shù)前3 d用左氧氟沙星滴眼液，4次/d；術(shù)前1 h用復(fù)方托吡卡胺滴眼液，共3次，間隔10 min；術(shù)前10 min術(shù)眼用鹽酸奧布卡因滴眼液(倍諾喜)3次，20 g/l利多卡因球后阻滯麻醉。所有患者手術(shù)過程順利，未出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥。

術(shù)后術(shù)眼常規(guī)給予醋酸潑尼松龍滴眼液(美國Alcon)，第1周4次/d，次數(shù)隨周次遞減，4周停藥；左氧氟沙星滴眼液(日本參天)，4次/d，2周后停用；妥布霉素地塞米松眼膏(美國Alcon)，睡前用，持續(xù)1周；根據(jù)眼部炎癥情況決定給藥周期，密切觀察眼壓變化情況。

由同一名住院醫(yī)師分別于術(shù)前1 d、術(shù)后1 d、1周、1個月、2個月及3個月分別評估患者雙眼以下指標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)干眼癥狀評估(standard patient evaluation of eye dryness,SPEED)問卷評分、淚膜破裂時(shí)間(tear break up time,TBUT)、瞼板腺分泌功能評分(meibomian glandy yielding secretion score,MGYSS)、Marx’s線評分(Marx’s line score,MLS)，并行結(jié)膜印跡細(xì)胞檢查(術(shù)后1 d除外)，評估杯狀細(xì)胞密度和形態(tài)變化。

三、觀察指標(biāo)

(一)常規(guī)眼科檢查

所有患者進(jìn)行常規(guī)眼科檢查以明確診斷和排除其他眼部疾病，包括最佳矯正視力(best corrected visual acuity，BCVA)、非接觸眼壓(Topcon, 日本)、裂隙燈顯微鏡檢查(角膜熒光素染色)、免散瞳彩色眼底照相(CR-2, Topcon, 日本)、譜域相干光層析成像術(shù)(spectral domain-optical coherence tomography,SD-OCT) (Haidelber，德國)。

(二)眼表功能檢查

1.SPEED問卷評分：用于評價(jià)患者干眼癥狀的嚴(yán)重程度和發(fā)作頻率的情況，評分為0～ 28分，分?jǐn)?shù)越高說明干眼癥狀越重。

2.熒光素染色淚膜破裂時(shí)間(fluorescein tear breakup time，F(xiàn)TBUT):將無菌生理鹽水浸濕的熒光素鈉條(1條/袋，中國天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司，天津)輕柔接觸患者下瞼結(jié)膜，避免刺激眼部，囑患者自然眨眼數(shù)次后，注視前方不眨眼。裂隙燈鈷藍(lán)光下觀察并記錄患者最后一次眨眼至淚膜出現(xiàn)第一個干燥斑的時(shí)間，重復(fù)3次，取3次結(jié)果平均值記為該眼TBUT值。

3.MGYSS:MGYSS是定量評估瞼板腺分泌功能的重要方法。根據(jù)Lane方案[15]，使用瞼板腺評估器(MGE; Tear Science, Inc., Morrisville, NC)，對患者瞼顳、中、鼻三處15個瞼板腺口的分泌功能進(jìn)行評分。各瞼板腺口評分標(biāo)準(zhǔn)如下：無分泌物；(1)濃縮的或牙膏狀分泌物；(2)混濁的液態(tài)分泌物；(3)清亮的液態(tài)分泌物。15個瞼板腺口分?jǐn)?shù)相加為該眼瞼MGYSS值，上、下眼瞼的MGYSS值相加記為該眼的MGYSS值，范圍0～90分。

4.MLS：Marx’s線位于瞼板腺開口(Meibomian orifices ，MOs)結(jié)膜面，熒光素鈉染色下其位置清晰顯現(xiàn)。研究表明，其位置與瞼板腺功能相關(guān)，越靠近皮膚面，提示瞼板腺功能越差。根據(jù)MASAHIKO評分方法[16],對患者下眼瞼顳、中、鼻3處(每處含3個瞼板腺開口)Marx’s 線位置進(jìn)行評分：0分，Marx’s 線完全位于瞼板腺開口結(jié)膜面；1分，Marx’s 線部分接觸瞼板腺開口；2分，Marx’s 線完全穿過瞼板腺開口處；3分，Marx’s線完全位于瞼板腺開口皮膚面(圖1)。

圖1 Marx’s線評分標(biāo)準(zhǔn)

5.結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)檢查：患者坐位, 鹽酸奧布卡因滴眼液(倍諾喜)局部麻醉結(jié)膜囊2 min后, 檢查者拇指與食指撐開并固定患者上下眼瞼, 以無菌平顳夾住濾紙一角, 粗糙面置于顳側(cè)球結(jié)膜(1～2點(diǎn)鐘方向，距角膜緣5 mm), 輕壓10 s后揭下, 置于95%濃度乙醇中固定2 h, 行PAS染色。光學(xué)顯微鏡下(×40)觀察杯狀細(xì)胞及上皮細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量特點(diǎn)，根據(jù)Nelson分級[17]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級。

6.Nelson分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，正常,上皮細(xì)胞小而圓,易分辨,細(xì)胞間緊密結(jié)合,胞質(zhì)嗜曙紅,核大,核漿比例為1：1～1：2,杯狀細(xì)胞>500/mm2,杯狀細(xì)胞大而圓,PAS重染；1級，輕度鱗狀上皮化生,上皮較大, 多形,易分辨,細(xì)胞間距離較0級大,細(xì)胞大,核小,核漿比1：3,杯狀細(xì)胞數(shù)量下降 (350～500/mm2) ,但仍圓而豐滿, PAS染色陽性持續(xù)。2級，中度鱗狀化生,上皮細(xì)胞大,多形,分辨差,細(xì)胞間距大,細(xì)胞質(zhì)多形性,細(xì)胞核可呈多核狀,核小,核漿比1∶4～1∶5,無角質(zhì)化,杯狀細(xì)胞嚴(yán)重減少100～350/mm2,形態(tài)小,周邊不清,PAS染色差。3級，重度鱗狀化生,上皮大而多形,孤立,胞質(zhì)偏藍(lán),核小,固縮并有較多的無核細(xì)胞,核漿比>1∶6,杯狀細(xì)胞數(shù)量下降甚至消失。見圖2。

圖2 光學(xué)顯微鏡下結(jié)膜印跡細(xì)胞PAS染色后的Nelson分級(PAS, 10×40)(a)Nelson分級0級(b) Nelson分級1級(c)Nelson分級4級(d)Nelson分級3級(Gautam T, 2015)

四 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

結(jié) 果

一、受檢者基本特征

本研究共納入研究對象共36例， 其中2例因個人原因無法進(jìn)行隨訪中途退出研究，4例因隨訪期間需要進(jìn)行二次眼科手術(shù)退出研究，最終完成隨訪30例。年齡在23～81歲，平均年齡(60±12.1)歲；其中男性12例，女性18例,診斷黃斑前膜8例。原發(fā)性或繼發(fā)性視網(wǎng)膜脫離12例,各種原因?qū)е碌牟Ａw積血10例(增生期糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜裂孔)；合并糖尿病7例，不合并糖尿病23例。

二、眼表功能指標(biāo)

1.SPEED問卷評分: 術(shù)后1 d、1周、1個月均大于術(shù)前1 d,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后2個月、3個月與術(shù)前1 d比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.TBUT：術(shù)后1 d、1周、1個月均低于術(shù)前1 d,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后2個月、3個月與術(shù)前1 d比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

3.MGYSS：術(shù)后1 d、1周、1個月均低于術(shù)前1 d,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后2個月、3個月與術(shù)前1 d比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

4. MLS：術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)與術(shù)前1 d比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

5.結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)Nelson分級：術(shù)后1周、1個月、2個月均高于術(shù)前1 d，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 30例行25G TSV患者術(shù)眼手術(shù)前后不同時(shí)間點(diǎn)SPEED問卷評分、TBUT、結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)、MGYSS、MLS結(jié)果

討 論

本研究對25G TSV前后患者干眼癥狀(SPEED問卷評分)、淚膜穩(wěn)定性(FTBUT)、瞼板腺功能(MGYSS)和結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度(Nelson分級)進(jìn)行了評估，旨在客觀評估25G TSV術(shù)后眼表功能改變及隨時(shí)間變化的趨勢，并初步探討25G TSV術(shù)后患者干眼癥狀發(fā)生發(fā)展的原因，以期為臨床上25G TSV術(shù)后干眼問題的預(yù)防和治療提供新思路。

一、SPEED問卷評分和FTBUT變化趨勢分析

SPEED問卷是評價(jià)干眼患者主觀癥狀發(fā)生頻率及嚴(yán)重程度的重要手段，本研究結(jié)果顯示術(shù)后1個月內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)的評分結(jié)果較術(shù)前明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中以術(shù)后1 d最高，而術(shù)后2個月時(shí)較術(shù)前略降低，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，術(shù)后3個月時(shí)較術(shù)前略升高，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示25G TSV會導(dǎo)致患者術(shù)后短期內(nèi)干眼癥狀加重，而在術(shù)后2個月內(nèi)恢復(fù)至術(shù)前水平。該結(jié)論與Tamer Wasfy等[18]和De等[19]的研究結(jié)果一致，即術(shù)后1 d及1周干眼癥狀最顯著。但是De等[19]僅評估患者術(shù)前及術(shù)后1周的干眼癥狀改變，未對更長時(shí)間的癥狀改變趨勢進(jìn)行評估和描述。本研究延長觀察時(shí)間至術(shù)后3個月，結(jié)果顯示25G TSV術(shù)后2個月以內(nèi)干眼癥狀基本恢復(fù)至術(shù)前水平。

FTBUT是評價(jià)淚膜穩(wěn)定性的客觀臨床指標(biāo)，本研究采用FTBUT評估25G TSV前后患者淚膜穩(wěn)定性的的變化趨勢，結(jié)果顯示術(shù)后1個月內(nèi)的FTBUT較術(shù)前明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中以術(shù)后1 d最低，而術(shù)后2個月、3個月時(shí)較術(shù)前略降低，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示25G TSV會導(dǎo)致患者短期內(nèi)淚膜穩(wěn)定性降低，而在術(shù)后2個月內(nèi)恢復(fù)至術(shù)前水平。Sato等[20]研究顯示25G TSV術(shù)后1個月內(nèi)患者FTBUT較術(shù)前明顯降低，該結(jié)果與本研究一致。但是該研究只隨訪至術(shù)后1個月，未對1個月后淚膜穩(wěn)定性改變進(jìn)行進(jìn)一步評估。本研究延長隨訪時(shí)間至術(shù)后3個月，結(jié)果顯示FTBUT在術(shù)后2個月時(shí)恢復(fù)至術(shù)前水平。

淚液中脂質(zhì)和黏蛋白成分的改變均可以影響淚膜穩(wěn)定性。為了探討25G TSV術(shù)后干眼形成的可能原因，本研究應(yīng)用MGYSS和結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)方法定量評估了瞼板腺功能和結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度。

二、MGYSS和MLS變化趨勢分析

MGYSS是定量評估瞼板腺分泌功能的有效方法。瞼板腺功能不良導(dǎo)致淚膜穩(wěn)定性降低，是蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼的主要原因。本研究顯示，術(shù)后1個月內(nèi)的MGYSS較術(shù)前明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示25G TSV會導(dǎo)致患者短期內(nèi)瞼板腺分泌功能下降。而觀察至術(shù)后2個月、3個月時(shí)，發(fā)現(xiàn)結(jié)果較術(shù)前略降低，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，反映該變化在術(shù)后2個月內(nèi)基本恢復(fù)至術(shù)前水平。目前對玻璃體切除術(shù)后瞼板腺分泌功能變化的研究很少。然而，已經(jīng)有大量研究表明其他內(nèi)眼手術(shù)，如白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)、屈光手術(shù)等會導(dǎo)致瞼板腺分泌功能下降[21-23]。而與常規(guī)白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)相比，25G TSV圍術(shù)期情況更加復(fù)雜多變，患者術(shù)后眼部炎癥反應(yīng)可能較白內(nèi)障手術(shù)嚴(yán)重，常需要使用更多種類和劑量的局部藥物及更長恢復(fù)時(shí)間；同時(shí)25G TSV本身平均手術(shù)時(shí)間較常規(guī)超聲乳化白內(nèi)障手術(shù)更長，開瞼器對瞼板腺的作用時(shí)間更長。因此，結(jié)合本研究的結(jié)果與白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)導(dǎo)致瞼板腺功能降低的機(jī)制進(jìn)一步明確了25G TSV對瞼板腺功能的影響。

Marx’s 線是指位于瞼結(jié)膜及皮膚交界處后方經(jīng)熒光素鈉等染色劑染色后可顯現(xiàn)出來的連續(xù)的線型結(jié)構(gòu)，會隨著年齡增加逐漸出現(xiàn)變寬和前移趨勢，且其前移總是以侵犯瞼板腺開口為首要表現(xiàn)[16，24]。因此，近年來Marx’s 線和瞼板腺功能之間的關(guān)系受到廣泛關(guān)注。本研究顯示，25G TSV雖然會造成短期內(nèi)瞼板腺分泌功能下降，但是對Marx’s 線位置并沒有明顯影響。而出現(xiàn)MGYSS和MLS變化趨勢不一致的結(jié)果并不是不合理的。關(guān)于Marx’s線的形成機(jī)制有不同假說，包括機(jī)械損傷等，近年來Bron[24]等提出溶質(zhì)梯度理論，認(rèn)為瞬目間淚新月水分蒸發(fā)會產(chǎn)生溶質(zhì)梯度，而其頂點(diǎn)處淚液滲透壓最大，長期的高滲狀態(tài)使該處形成Marx’s線。雖然既往研究表明[24]，玻璃體切除術(shù)后1個月內(nèi)淚新月高度增加，尤其1周時(shí)增加顯著，但是Marx’s線位置的變化涉及長期刺激下的細(xì)胞移行過程，發(fā)展時(shí)間較長，這解釋了本研究中Mmarx’s線評分無明顯改變的可能原因。

三、結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)Nelson分級變化趨勢分析

分泌淚液中黏蛋白成分的結(jié)膜杯狀細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)，是干眼相關(guān)研究的熱點(diǎn)。本研究顯示，術(shù)后2個月內(nèi)的結(jié)膜印跡細(xì)胞Nelson分級較術(shù)前明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，術(shù)后3個月時(shí)較術(shù)前略升高，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示25G TSV會導(dǎo)致患者短期內(nèi)結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度減少及結(jié)膜上皮細(xì)胞鱗狀化生，該變化在術(shù)后3個月內(nèi)基本恢復(fù)至術(shù)前水平。該結(jié)果與Heimann等[25]對PPV術(shù)后患者的結(jié)膜標(biāo)本進(jìn)行HE染色和免疫組化染色發(fā)現(xiàn)術(shù)后結(jié)膜上皮層增厚，杯狀細(xì)胞減少的結(jié)果一致。Heimann等[25]具體描述了PPV造成的結(jié)膜細(xì)胞形態(tài)異常的四種表現(xiàn)，首先是術(shù)后結(jié)膜上皮層增厚，表達(dá)黏蛋白MUC5A的杯狀細(xì)胞數(shù)量減少；其次，PPV術(shù)后黏蛋白MUC1的表達(dá)局限在外層結(jié)膜上皮，而正常情況下MUC1在結(jié)膜上皮全層都有表達(dá)；第三，細(xì)胞表面的硫酸類肝素蛋白多糖syndecan-1起到調(diào)節(jié)結(jié)膜細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的連接的作用。正常情況下，其存在于結(jié)膜上皮全層，并從結(jié)膜內(nèi)層到外層數(shù)量逐漸減少，而PPV術(shù)后這種階梯性消失，表現(xiàn)為syndecan-1在全層中重度表達(dá)；第四，蛋白多糖TN-C與細(xì)胞間連接和傷口愈合相關(guān)。正常情況下在結(jié)膜上皮組織中輕度表達(dá)，PPV術(shù)后結(jié)膜上皮內(nèi)TN-C表達(dá)水平升高。上述結(jié)膜組織的異常，尤其是表達(dá)MUC5A黏蛋白的杯狀細(xì)胞數(shù)量減少和表達(dá)MUC1黏蛋白的上皮細(xì)胞的分布異?？赡軐?dǎo)致術(shù)后干眼的發(fā)生。由于該研究為橫斷面研究，不能觀察PPV術(shù)后結(jié)膜形態(tài)的動態(tài)變化趨勢。本研究通過結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)方法對25G TSV術(shù)后結(jié)膜上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的改變進(jìn)行了3個月的連續(xù)性動態(tài)評估，發(fā)現(xiàn)杯狀細(xì)胞密度變化在術(shù)后3個月可基本恢復(fù)術(shù)前水平。

總之，本研究結(jié)果提示25G TSV術(shù)后短期內(nèi)患者眼表功能顯著降低。患者出現(xiàn)的干眼癥狀、淚膜穩(wěn)定性、瞼板腺分泌功能結(jié)果均較術(shù)前差，但在術(shù)后2個月內(nèi)恢復(fù)至術(shù)前水平。結(jié)膜印跡細(xì)胞Nelson分級在術(shù)后的改變持續(xù)至術(shù)后3個月，3個月內(nèi)恢復(fù)術(shù)前水平。而術(shù)后MLS未見明顯改變。瞼板腺分泌功能降低和杯狀細(xì)胞數(shù)量減少將直接影響淚膜中的脂質(zhì)和黏蛋白成分，從而造成術(shù)后淚膜穩(wěn)定性降低，是誘發(fā)術(shù)后干眼或癥狀加重的重要原因。盡管25G TSV已經(jīng)較傳統(tǒng)的PPV有很大改進(jìn)，但仍不可避免地會對眼表組織有一定損害。分析25G TSV后眼表功能降低的原因可能與手術(shù)過程中眼表長期暴露、術(shù)中操作產(chǎn)生的結(jié)膜角膜機(jī)械性損傷、開瞼器作用、術(shù)后炎癥反應(yīng)、圍術(shù)期局部用藥以及聚維酮碘消毒液沖洗結(jié)膜囊產(chǎn)生細(xì)胞毒性等多種因素相關(guān)。

小樣本量是本研究的主要局限性，可能導(dǎo)致抽樣誤差增大，從而影響結(jié)論的代表性。其次，納入的研究對象年齡跨度較大，且平均年齡較大，而年齡是影響干眼發(fā)病的原因之一，因此年齡因素可能會給研究結(jié)果帶來偏倚。另外，納入研究對象中包含了一部分糖尿病患者，糖尿病同樣是影響眼表功能的重要因素之一，可能會帶來偏倚。除此之外，考慮到影響術(shù)后眼表功能變化的因素的復(fù)雜性和樣本量的局限性，本研究暫時(shí)未對各因素進(jìn)行進(jìn)一步多元線性回歸分析和病因模型探索。因此，25G TSV 對眼表功能的影響，還需要更多的、設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯坑枰赃M(jìn)一步驗(yàn)證。