王志強 張慧華

(1.南陽市經濟作物技術推廣站，河南南陽 473000；2.河南民興生物科技股份有限公司，河南社旗 473300)

纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)是一種多功能的細胞外基質糖蛋白，由兩個幾乎相同的分子量為220 kD的二硫鍵結合多肽組成[1]。細胞纖連蛋白在結構上和抗原性上類似于來自血漿的冷不溶性球蛋白，因此形成的多克隆抗體通常交叉反應[2]。FN分子含有幾個功能和結構上不同的結構域，它們可以結合細胞表面受體，結合膠原蛋白、纖維蛋白原或纖維蛋白以及糖胺聚糖、蛋白多糖和肝素等[3]。因FN在液體狀態(tài)下極易降解，致使其生物活性下降，所以將FN制備成凍干制劑是目前最常見的保存形式[4]。目前FN制劑中的保護劑為1%～2%的血清白蛋白和2%～3%的明膠等高分子聚合物。然而，由于血清白蛋白潛在的血源性病原體污染限制了其在蛋白產品中的應用，另外明膠受限于其濃度，濃度過大時會增加最終制劑的水分[5]。

絲膠是被覆于絲素外層的一種球狀蛋白，約占蠶絲的20%～30%，其分子量在1.0～200 kD不等，含絲氨酸、天門冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、精氨酸等18種氨基酸，其中包括人體所必需的八種氨基酸；絲膠蛋白中絲氨酸和天門冬氨酸等極性側基氨基酸極高，是一種親水基團極豐富的蛋白質，具有良好的水溶性和抗氧化性強[6]等特性。絲膠蛋白現(xiàn)已作為細胞培養(yǎng)的基質和促進細胞有絲分裂和增殖的添加物[7]， Kazuhisa等[8]發(fā)現(xiàn)絲膠蛋白對細胞和蛋白質有凍結保護作用，其抗凍保護作用與常見的抗凍保護劑牛血清白蛋白(BSA) 相當[9-11]。本試驗將絲膠蛋白精制純化后用作牛血漿FN的凍干保護劑，顯現(xiàn)出良好的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料

絲膠蛋白粉，分子量為8～30 kD， 河南民興生物科技股份有限公司絲膠提取設備生產，蛋白質含量87.3%(純度87.3%)，具體生產方法參見文獻[12]；成年牛血漿，購自鄭州九龍生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑

明膠-瓊脂糖凝膠 Gelatin Sepharose 4B(以下簡稱明膠親和介質),美國GE公司產品；間充質干細胞(MSC 細胞)，有北京科霖恩生物科技有限公司郭子寬教授贈送；乳糖、甘露醇、碳酸鈉、檸檬酸三鈉、右旋糖苷40、濃鹽酸、尿素、精氨酸、丙烯酰胺、N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺，國藥試劑，均為分析純；BCA蛋白質定量試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；氯化鈉、葡聚糖凝膠G-25，三羥甲基氨基甲烷、5×蛋白上樣緩沖液(含DTT)、四甲基乙二胺、過硫酸銨、甲醇、硫酸銨、冰醋酸、彩虹180 光譜marker ( M )11～180 kD 、10×電泳轉移緩沖液、十二烷基硫酸鈉(Tris)、甘氨酸、考馬斯亮藍 G-250，北京索萊寶有限公司，均為分析純；木瓜蛋白酶、聚乙二醇4000、明膠、重組人FN凍干粉、牛血清白蛋白(BSA)、纖維素酶、DMEM培養(yǎng)基，美國-Sigma-公司，均為細胞級。

1.1.3 主要儀器

LPG-5型高速離心噴霧干燥機，購自常州市升溢干燥設備有限公司；LGJ-50E 型真空冷凍干燥機，購自四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展(北京)有限公司 ；層析柱、恒溫水浴鍋、層析柜、PHS-3E型pH計、超純水機，購自浙江力辰儀器科技有限公司；即用型透析袋(截留分子量3.5 kD、10.0 kD)、變性蛋白電泳預制膠(8%),購自北京索萊寶科技有限公司；凱式定氮儀，購自上海精密科學儀器有限公司；DYY-300型電泳儀，購自美國Bio-Rad公司；超凈工作臺、酶標儀、電動移液器，購自美國Thermo公司；電子天平，精度 0.001 g，購自上海恒平科學儀器有限公司；磁力攪拌器，購自常州市金壇大地自動化儀器廠； 96孔細胞培養(yǎng)板、150 mm細胞養(yǎng)皿、50 mL離心管、移液管，美國Corning公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 絲膠蛋白精制純化

水解絲膠蛋白：稱取20.0 g絲膠蛋白粉和8.0 g木瓜蛋白酶于燒杯中 ,加入pH為8.0的Tris-HCl緩沖液中，在42 ℃下水浴2 h后，然后再加入8.0 g木瓜蛋白酶繼續(xù)水浴，2 h后，再次加入木瓜蛋白酶16.0 g，繼續(xù)水浴2 h，停止水解，將水浴鍋溫度調節(jié)至65 ℃ 并保持30 min以滅活過量的木瓜蛋白酶，留樣并做電泳分析。選擇截留分子量為10 kD的透析袋，將上述經木瓜蛋白酶水解的絲膠溶液透析，得到透析液1。去除絲膠蛋白中的碳水化合物：稱取6.0 g的纖維素酶于10 mL純化水中，即配定出體積百分比濃度為60 % 的纖維素酶溶液，將透析液1與纖維素酶溶液按3∶1的比例混合，在40 ℃下水浴4 h后，將水浴鍋調節(jié)至升65 ℃保持30 min以滅活過量的纖維素酶，選擇截留分子量為3.5 kD的透析袋，將上述經纖維素酶水解的絲膠溶液透析，得到透析液2。濃縮干燥：將透析液2經高速離心噴霧干燥機濃縮干燥，即得到了精制絲膠蛋白粉，用凱式定氮儀檢測精制絲膠蛋白粉的總氮含量，計算蛋白質含量。SDS-PAGE 法測其分子量。

1.2.2 FN分離

采用親和層析的方法分離純化FN。具體過程如下：將明膠親和介質填充至層析柱中，并用Tris-檸檬酸鈉緩沖液衡平衡明膠親合介質；取解凍的成年牛血漿100 mL，8500 r/min，離心10 min，棄沉淀，收集上清液,并在37 ℃下復溫30 min備用；稀釋上述血漿至500 mL，上柱親和，置層析柜中(7 ℃)，控制流速恒定在75～90 mL/h；洗滌雜蛋白，將明膠親和介質用1 500 mL的 Tris-檸檬酸鈉平衡液洗滌3～5次，最后用含1 M的 NaCl的Tris-檸檬酸鈉緩沖液流洗明膠親和介質1～2次；解離目標蛋白，用含4 M尿素的Tris-檸檬酸鈉緩沖液洗滌明膠親和介質2～3次，收集洗滌液，即得到含有目標蛋白FN的溶液；濃縮除鹽，通過葡聚糖凝膠G-25介質，用20 mmol的檸檬酸緩沖液對上述含F(xiàn)N的溶液層析除鹽，通過紫外吸收儀檢測并收集層析流出液。采用SDS-PAGE 法檢測其分子量。

1.2.3 保護劑篩選

設計4組蛋白保護劑處方分別加入經濃縮除鹽后的FN溶液中, 冷凍干燥后觀察外觀進行篩選, 具體分組見表1。

表1 試驗分組

1.2.4 長期穩(wěn)定性實驗

降解是蛋白質不穩(wěn)定的明顯表現(xiàn)，因FN分子量較大，為45 000 kD，極易降解。 因此將1.2.3 中的4組凍干FN制劑在室溫進行長期穩(wěn)定性試驗。上述在室溫下分別保存6個月、12個月和30 個月后，用SDS-PAGE 法測定凍干FN制劑分子量，觀察是否降解。

1.2.5 FN凍干制劑活性檢測

將凍干的FN加入注射用水溶解,調整濃度向96孔細胞培養(yǎng)板各孔中加入100 μL體積質量濃度為5μg/mL的FN蛋白溶液, 室溫下孵育3 h, 沒有吸附的FN 以PBS沖洗3次, 包被完成后。MSC細胞懸浮于DMEM 培養(yǎng)液中, 調整其濃度，使?jié)舛却蠹s在105 cells/mL。向孔中加入100 μL的細胞懸浮液,并用PBS做空白對照試驗， 37 ℃下孵育30 min, PBS洗滌未被吸附的細胞, 并在顯微鏡下觀察細胞貼壁現(xiàn)象。

2 結果與分析

2.1 精制純化的絲膠蛋白分子量確定及蛋白質含量測定

試驗選用木瓜蛋白酶水解絲膠蛋白粉。木瓜蛋白酶作用溫和，對蛋白質損傷較小，屬巰基蛋白酶，作用于蛋白質中L-精氨酸、L-賴氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸殘基羧基參與形成的肽鏈，屬于內切酶，能切開全蛋白質分子內部肽鏈CO-NH，生成分子量較小的多肽類。水解后透析，再經纖維素酶水解去除碳水化合物，透析，最后經高速離心噴霧干燥制得精制純化的絲膠蛋白粉。SDS-PAGE測其分子量，結果如圖1所示，精制純化后的絲膠蛋白分子量集中分布在14.4 kD。

M—蛋白標準品 marker(范圍：14.4～97.4 kD)

M—蛋白標準品 marker(范圍：11～180 kD)

M—蛋白標準品 marker(范圍：11～180 kD)

用凱式定氮儀測得精制絲膠蛋白粉的總氮含量為15.278%，計算得出蛋白質含量為98.3%(氮轉換系數(shù)6.25)。

2.2 分離純化的FN分子量確定

基于FN與變性膠原蛋白(通常為明膠)的高特異親和性的結合，試驗通過明膠親和介質從牛血漿中分離出含F(xiàn)N溶液，再經G-25除鹽，制備FN。SDS-PAGE 法檢測其分子量，從圖2可以看出FN單鏈分子量為220 kD。通常FN 以分子量為450 kD左右的二聚體形式存在, 單體分子量為220～250 kD, 由位于蛋白質羧基端的二硫鍵相連。

2.3 FN凍干制劑長期穩(wěn)定試驗

設計4組蛋白保護劑配方分別加入經濃縮除鹽后的FN溶液中, 冷凍干燥，制備凍干粉，在室溫下保存30個月，SDS-PAGE 法檢測其是否降解。結果如圖3所示。結果顯示FN凍干制劑在配方Ⅰ和Ⅱ下，保存30個月不降解，在配方Ⅲ和Ⅳ下，保存30個月后明顯出現(xiàn)降解。結果說明含絲膠蛋白的FN凍干制劑穩(wěn)定性可與常規(guī)保護劑血清白蛋白相媲美。

2.4 FN凍干制劑活性檢測

與FN直接作用的氨基酸序列為Arg -Gly -Asp-Ser, 當FN以不可溶形態(tài)固定于培養(yǎng)板表面時, 這些序列就可以促進細胞的貼壁, 因此在細胞培養(yǎng)中FN具有促進細胞相互作用、有利于細胞貼壁及平鋪的生物功能[12-13，20]。利用該原理做活性檢測試驗，結果顯示：從MSC細胞培養(yǎng)檢測牛血漿中FN活性實驗中可以觀察到, 加有FN凍干制劑和加有FN標準品(重組人FN 樣品)的組織培養(yǎng)孔中均有大量的細胞貼壁, 而空白孔中細胞卻沒有貼壁。由此可以說明采Gelatin-Sepharose 4B分離純化方法得到的牛血漿FN，再引入絲膠蛋白做為FN的凍干保護劑，檢測其生物活性，結果表明其與人FN具有相同的生物活性。

3 小結與討論

FN是一種分布很廣泛的高分子量糖蛋白, 存在于血漿、細胞胞內及不同細胞表面中, 通常以分子量為450 kD 左右的二聚體形式存在, 單體分子量為220 kD左右, 由位于蛋白質羧基端的二硫鍵相連。其具有與細胞外基質如膠原、血纖蛋白、肝素等物質的結合位點, 因此在很多重要的生理過程如傷口愈合、止血和凝血中都發(fā)揮著重要的作用。FN常制備為凍干粉保存，本文在FN凍干制劑中引入經精制純化的絲膠蛋白做為其凍干保護劑，表現(xiàn)出與血清白蛋白相同的效果， FN凍干制劑在配方Ⅰ(2%絲膠蛋白+1%甘露醇)和Ⅱ(1%絲膠蛋白+1%PEG 4000+1%甘露醇)下，保存30個月不降解，活性檢測結果顯示FN凍干制劑生物活性可與重組人FN相媲美。

絲膠蛋白作為一種含有18種氨基酸的球狀蛋白質，其作為促進細胞生長、組織再生[24]等的載體并完成了組織再生的目的后，還能被人體組織所吸收，進入人體循環(huán)代謝，提供康復營養(yǎng)[25]?；诒姸鄡?yōu)勢，絲膠蛋白作為組織工程支架的研究備受關注，正逐漸成為生物醫(yī)學領域最有前景的生物材料之一[18]。本文以經精制純化的絲膠蛋白作為FN凍干制劑的保護劑，實驗結果表明：絲膠蛋白對蛋白質有凍結保護作用，其抗凍保護作用與常見的抗凍保護劑牛血清白蛋白(BSA) 相當。