馬冬梅 陶慶春 蔣東葵 李世亮

鮑曼不動桿菌，是臨床檢出率較高的病原菌，隨著抗生素的大量使用，近些年來鮑曼不動桿菌耐藥率較高，其中廣泛耐藥株的檢出率也呈不斷上升趨勢[1-4]。本次試驗采用微量肉湯稀釋法測定板藍(lán)根、魚腥草、金銀花、連翹單用以及與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)用對30株臨床分離廣泛耐藥鮑曼不動桿菌的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，分析比較不同中草藥與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合的抑菌作用，為治療廣泛耐藥鮑曼不動桿菌感染提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

自2018年9月12日至2019年10月19日收集北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院臨床分離的廣泛耐藥鮑曼不動桿菌，藥敏結(jié)果遵照CLSI M100-S28執(zhí)行，選出30株廣泛耐藥株(排除同一病人重復(fù)株)，質(zhì)控菌株：大腸埃希氏菌ATCC25922。

1.2 培養(yǎng)基

伊紅美蘭平板(OXOID公司)、血平板(OXOID公司)、麥康凱選擇平板(OXOID公司)、M-H肉湯培養(yǎng)基(OXOID公司)、M-H瓊脂培養(yǎng)基(OXOID公司)。

1.3 試驗藥物

板藍(lán)根顆粒(北京康仁堂藥業(yè)有限公司，批號:20191105)、魚腥草顆粒(北京康仁堂藥業(yè)有限公司，批號:20191028)、金銀花顆粒(北京康仁堂藥業(yè)有限公司，批號:20191113)、連翹顆粒(北京康仁堂藥業(yè)有限公司，批號:20191010)，頭孢哌酮/舒巴坦(頭孢哌酮/舒巴坦2∶1，輝瑞制藥，批號：1847364)。

1.4 儀器設(shè)備

自動微生物鑒定藥敏分析儀(BD公司Phoenix100)、比濁儀(BD公司)、電子分析天平(賽多利斯)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京科偉醫(yī)療器械廠)、200 uL微量加樣器、96孔板。

1.5 試驗菌液配制

分別取鑒定分純的30株廣泛耐藥鮑曼不動桿菌菌落，溶于生理鹽水用比濁儀校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷?，再用MH肉湯稀釋100倍備用(相當(dāng)于細(xì)菌數(shù)1×106CFU/mL的菌液)。

1.6 最低抑菌濃度測定

分別配置板藍(lán)根、魚腥草、金銀花、連翹原始藥液，濃度為500 mg/mL，取無菌的96孔板，采用微量肉湯稀釋法分別將原始藥液用MH肉湯依次對倍稀釋加入第1至第10孔，每孔加藥液100 μL，各組藥物配制濃度范圍為250 mg/mL～0.5 mg/mL，然后每孔加入試驗菌液100 μL，同時做空白和陽性對照，35℃培養(yǎng)24小時，測定各藥物對30株菌的最低抑菌濃度(MIC)。配制頭孢哌酮/舒巴坦原始藥液濃度1024 μg/mL，其它操作步驟同上，測定頭孢哌酮/舒巴坦對30株菌的MIC。

1.7 聯(lián)合用藥試驗

根據(jù)30株廣泛耐藥鮑曼不動桿菌對板藍(lán)根、魚腥草、金銀花、連翹、頭孢哌酮/舒巴坦的MIC結(jié)果，分別取2倍MIC為最高稀釋濃度，按倍比稀釋各自配制8個稀釋濃度，將配好的不同濃度的板藍(lán)根、魚腥草、金銀花、連翹分別與頭孢哌酮/舒巴坦各50 μL，按棋盤法設(shè)計兩兩混合組合加入96孔板，再分別加入30株試驗菌液100 μL，35℃培養(yǎng)24小時。選擇上述30組棋盤模型中兩藥聯(lián)合最佳組合效應(yīng)時的MIC值，記錄并計算部分抑菌濃度(fraction inhibitory concentration，F(xiàn)IC)指數(shù)。

1.8 結(jié)果判讀

FIC指數(shù)=甲藥聯(lián)合的MIC/甲藥單用的MIC+乙藥聯(lián)合的MIC/乙藥單用的MIC，計算FIC指數(shù)。FIC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用，0.52為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 各組中藥的MIC結(jié)果

板藍(lán)根、魚腥草、金銀花、連翹與頭孢哌酮/舒巴坦單用和聯(lián)用對30株廣泛耐藥鮑曼不動桿菌的藥物最低抑菌濃度MIC值、MIC50、MIC90，結(jié)果分別見表1、表2、表3、表4。4種中草藥對廣泛耐藥鮑曼不動桿菌均具有一定的抑菌作用，其中魚腥草的MIC值最高、連翹的MIC值最低，連翹的體外抑菌效果明顯好于其他3種。聯(lián)合用藥抑菌效果來看，板藍(lán)根、魚腥草與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合用藥，MIC值比單獨用藥有明顯降低；金銀花與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合用藥，金銀花MIC值范圍的最大值略有升高、頭孢哌酮/舒巴坦MIC值范圍有所降低，兩者M(jìn)IC50、MIC90與均沒有變化；連翹與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合用藥，MIC50、MIC90與單獨用藥相比反而升高了。

表2 魚腥草、頭孢哌酮/舒巴坦(SCF)單用以及聯(lián)用對廣泛耐藥鮑曼不動桿菌的MIC值范圍

表3 金銀花、頭孢哌酮/舒巴坦(SCF)單用以及聯(lián)用對廣泛耐藥鮑曼不動桿菌的MIC值范圍

表4 連翹、頭孢哌酮/舒巴坦(SCF)單用以及聯(lián)用對廣泛耐藥鮑曼不動桿菌的MIC值范圍

2.2 濃度—累積抑菌百分率曲線

頭孢哌酮/舒巴坦(SCF)單用和與板藍(lán)根(BLG)、魚腥草(YXC)、金銀花(JYH)、連翹(LQ)聯(lián)用濃度—累積抑菌百分率。結(jié)果見表5、圖1。圖1顯示，頭孢哌酮/舒巴坦與板藍(lán)根、魚腥草、金銀花聯(lián)合應(yīng)用與單用相比，曲線在一定范圍內(nèi)左移，表明頭孢哌酮/舒巴坦與板藍(lán)根、魚腥草、金銀花聯(lián)用比單用MIC值在一定范圍內(nèi)有所降低，尤其與板藍(lán)根聯(lián)用，曲線左移明顯，聯(lián)合抑菌效果較好；頭孢哌酮/舒巴坦與連翹聯(lián)合應(yīng)用與單用相比，濃度—累積抑菌百分率曲線一定范圍內(nèi)明顯右移，兩藥聯(lián)用比單用MIC值在一定范圍內(nèi)有所升高。

圖1 頭孢哌酮/舒巴坦單用和聯(lián)用濃度—累計抑菌率

表5 頭孢哌酮/舒巴坦(SCF)單用和聯(lián)用濃度-累積抑菌百分率

2.3 FIC指數(shù)分布

板藍(lán)根等與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合應(yīng)用對廣泛耐藥鮑曼不動桿菌FIC指數(shù)分布。結(jié)果見表6。板藍(lán)根與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)用FIC指數(shù)：FIC≤0.5為26.7%，0.52為0%；魚腥草與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)用FIC指數(shù)：FIC≤0.5為26.7%，0.52為0%；金銀花與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)用FIC指數(shù)：FIC≤0.5為0%，0.52為20%；連翹與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)用FIC指數(shù)：FIC≤0.5為0%，0.52為73.3%。

表6 板藍(lán)根等與頭孢哌酮/舒巴坦(SCF)聯(lián)合應(yīng)用FIC指數(shù)分布

3 討論

近年來，鮑曼不動桿菌的檢出率和耐藥率都呈現(xiàn)較高水平，高耐藥率和復(fù)雜的耐藥機制[5-6]嚴(yán)重影響臨床療效。鮑曼不動桿菌感染診治專家共識指出：耐藥菌株根據(jù)藥敏可以選用頭孢哌酮/舒巴坦、氨芐西林/舒巴坦或碳青霉烯類，聯(lián)合應(yīng)用其他類抗菌藥物治療[7]，有相關(guān)研究表明聯(lián)合應(yīng)用兩種抗菌藥物對多重耐藥鮑曼不動桿菌表現(xiàn)較好的抗菌活性[8]。

中藥作為中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要部分，具有資源豐富、副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等特點，越來越顯示出獨特優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于臨床。板藍(lán)根、魚腥草、金銀花、連翹這幾味常用中草藥，在清熱解毒抗感染治療中發(fā)揮著重要作用。頭孢哌酮/舒巴坦有研究表明抗菌活性較好[9-11]，在全國細(xì)菌耐藥檢測數(shù)據(jù)顯示對鮑曼不動桿菌耐藥率較低。中藥的抗菌作用以及與抗生素聯(lián)合應(yīng)用越來越受研究關(guān)注，也在臨床廣泛應(yīng)用。趙英妹等[12]分析了8種中草藥對臨床常見菌株的體外抑菌活性，結(jié)果顯示黃連、金銀花、野菊花、連翹和大黃對金黃色葡萄球菌、有較強的抑菌作用；黃連和金銀花對大腸埃希菌也有一定的抑菌作用。高貴陽等[13]研究發(fā)現(xiàn)魚腥草、連翹、黃芩對銅綠假單胞菌有一定抗菌活性。張國祖等[14]將連翹與頭孢噻呋聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)對耐藥大腸埃希氏菌聯(lián)合抑菌效果以協(xié)同作用為主，與恩諾沙星聯(lián)用時以拮抗作用為主。賈芳等[15]做了魚腥草素鈉和氨芐西林對表皮葡萄球菌的聯(lián)合試驗，結(jié)果顯示聯(lián)合應(yīng)用與單獨應(yīng)用相比MIC明顯降低，F(xiàn)IC指數(shù)顯示均為協(xié)同作用。

本次試驗藥物結(jié)果顯示：板藍(lán)根、魚腥草、金銀花、連翹單獨應(yīng)用對廣泛耐藥鮑曼不動桿菌均具有一定的抑菌作用，其中連翹的MIC值最低，抑菌效果明顯好于其他三種。不同中草藥與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合應(yīng)用也表現(xiàn)出了不同的抑菌效果，其中板藍(lán)根與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合抑菌效果最好。中藥通過損傷細(xì)菌細(xì)胞膜、抑制細(xì)菌的外排泵、干擾細(xì)菌組分合成等[16-18]因素實現(xiàn)抗菌活性，但具體抑菌機制，還需進(jìn)一步研究。此外本次實驗采用體外抑菌試驗，在體內(nèi)的抑菌效果如何也有待進(jìn)一步驗證。