梁自飛，吳安石，沈文振，魏昌偉#

(1.北京朝陽急診搶救中心麻醉科，北京 100020； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院麻醉科，北京 100020)

三叉神經(jīng)痛(trigeminal neuralgia，TN)是指機(jī)體三叉神經(jīng)分布區(qū)域由于受到某些觸覺刺激，如說話、洗臉及刷牙等，引發(fā)的劇烈疼痛，有時(shí)會(huì)附帶面部的痛性痙攣，中老年女性易患該病[1]。TN易發(fā)生于面部右側(cè)，可對(duì)患者身體健康造成嚴(yán)重影響，亦會(huì)影響患者的精神生活[2]。一般情況下，機(jī)體為維持局部生理平衡，末梢神經(jīng)中包含著各種非神經(jīng)細(xì)胞，當(dāng)神經(jīng)受到損傷時(shí)，這些細(xì)胞會(huì)釋放白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等炎癥因子，引起神經(jīng)組織產(chǎn)生相關(guān)遞質(zhì)，在痛覺傳遞神經(jīng)處產(chǎn)生作用，使痛閾降低，產(chǎn)生疼痛[3]。NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體為胞內(nèi)模式識(shí)別受體，可激發(fā)調(diào)節(jié)免疫及炎癥反應(yīng)，由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)和胱天蛋白酶1(caspase-1)組成通路，對(duì)各種炎癥反應(yīng)具有一定調(diào)節(jié)作用[4]。降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)在血管擴(kuò)張和痛覺傳導(dǎo)中有重要作用，近年來研究結(jié)果表明，CGRP與TN的發(fā)生密切相關(guān)[5-6]。鹽酸小檗堿是從中藥黃連中分離而來，為黃連的主要有效成分，具有抗菌、抗腫瘤、抗肺結(jié)核以及消炎等功效[7]。但是，其對(duì)TN的治療作用尚不明確。本研究通過制備TN模型大鼠，分析鹽酸小檗堿對(duì)TN模型大鼠的作用及對(duì)NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的影響，以期為明確其具體機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：Electric Von Frey型電子測(cè)痛儀(天津儀數(shù)科技有限公司)；ELx800型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)；TL988型qRT-PCR儀(西安天隆科技有限公司)；Gel Doc XR+型蛋白凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.1.2 藥品與試劑：鹽酸小檗堿(原料藥，純度98.5%，長(zhǎng)沙禎祥生物科技有限公司，批號(hào)為633-65-8)；IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA)試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)為RAB3219、RAB0328)；RNA抽提試劑盒(北京天根生化科技有限公司，批號(hào)為DP419)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司，批號(hào)為RRO37 A)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒(美國(guó)Genecopoeia公司，批號(hào)為QP115)；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)Thermo公司，批號(hào)分別為C510003、C503021)；兔抗鼠CGRP、NLRP3、ASC、caspase-1及β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)一抗(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為ab5419、ab3520、ab3518、abB3517及ab3508)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜、羊抗鼠IgG二抗(上海生工生物工程有限公司，批號(hào)分別為F619537、D110098)。

1.1.3 動(dòng)物：SPF清潔級(jí)雄性SD大鼠75只，周齡8～9周，體重220～250 g，購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(浙)2019-0012，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(浙)2019-0031，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為191103057。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物建模、分組及給藥：實(shí)驗(yàn)前l(fā)周，使用電子測(cè)痛儀適應(yīng)性刺激大鼠三叉神經(jīng)支配區(qū)域，使大鼠適應(yīng)后痛閾>26，每日連續(xù)5次。隨機(jī)取15只大鼠設(shè)為假手術(shù)組，剩下60只大鼠均采用眶下神經(jīng)縮窄術(shù)(ION-CCI)[8]制備TN大鼠模型，即腹腔注射水合氯醛(3 ml/kg)100 g/L麻醉，剔除大鼠右側(cè)面部全部毛發(fā)并用酒精消毒，于大鼠眶下緣3～4 mm處，緊貼鼻根，沿鼻骨方向長(zhǎng)約3～5 mm處切口，分離出2條眶下神經(jīng)(相隔約1 mm)，使用4-0烙制羊腸線結(jié)扎(假手術(shù)組僅分離眶下神經(jīng)，不結(jié)扎，其于操作步驟與上述相同)。將建模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、鹽酸小檗堿低劑量組、鹽酸小檗堿中劑量組及鹽酸小檗堿高劑量組，每組15只。鹽酸小檗堿低、中及高劑量組大鼠分別予以鹽酸小檗堿溶液25、50及100 mg/kg灌胃[9]，假手術(shù)組和模型組大鼠則分別予以等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，灌胃體積10 ml/kg，1日1次，共給藥14 d。手術(shù)過程中，所用物品均高壓滅菌，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2 機(jī)械痛閾值的測(cè)定：各組大鼠分別在建模前3 d、建模前1 d行機(jī)械刺激適應(yīng)，建模成功后1 d開始，每間隔1 d用電子測(cè)痛儀刺激眶下神經(jīng)分布區(qū)域[10]。每只大鼠刺激6次，每次間隔1 min。當(dāng)大鼠出現(xiàn)以下任何一種行為學(xué)變化時(shí)記為陽性反應(yīng)，①退縮反應(yīng)，受刺激后動(dòng)物表現(xiàn)為快速后退；②搔臉行為，連續(xù)搔抓面部刺激區(qū)域；③攻擊行為，大鼠快速抓撓刺激物做出攻擊動(dòng)作。觀察電子測(cè)痛儀數(shù)值，記錄使大鼠產(chǎn)生陽性反應(yīng)的強(qiáng)度最小值，即為術(shù)側(cè)機(jī)械痛閾值。

1.2.3 大鼠術(shù)側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)組織獲取：術(shù)后第15日，應(yīng)激實(shí)驗(yàn)完成后，各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(3 ml/kg)100 g/L麻醉，實(shí)施安樂死，分離并收集大鼠術(shù)側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)組織，平均分為3份并置于-80 ℃保存，分別用于后續(xù)ELISA、qRT-PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot，WB)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.4 ELISA法分別測(cè)定術(shù)側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)組織中IL-1β、TNF-α含量：從“1.2.3”項(xiàng)中的-80 ℃冰箱取出1份術(shù)側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)組織，冰上融化，用0 ℃、0.9%氯化鈉溶液制成5%勻漿后，于4 ℃、1 200 r/min下離心15 min，取上清液。具體操作步驟按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，測(cè)量樣本490 nm處光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織中IL-1β、TNF-α含量。

1.2.5 qRT-PCR法檢測(cè)術(shù)側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)組織中CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1 mRNA表達(dá)情況：從“1.2.3”項(xiàng)中的-80 ℃冰箱取出1份術(shù)側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)組織，冰上融化，采用RNA抽提試劑盒提取各組大鼠神經(jīng)節(jié)組織總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒說明書配置PCR反應(yīng)體系，即2×SYBR mix 10 μl，H2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl，10×cDNA模板1 μl。反應(yīng)條件設(shè)定為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火50 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。分別以GAPDH作為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt算法計(jì)算mRNA表達(dá)水平。CGRP、NLRP3、ASC、caspase-1及GAPDH引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 qRT-PCR primer sequence

1.2.6 WB法檢測(cè)術(shù)側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)組織中CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1蛋白表達(dá)情況：從“1.2.3”項(xiàng)中的-80 ℃冰箱取出1份大鼠術(shù)側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)組織，提取總蛋白并對(duì)蛋白進(jìn)行定量。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)PVDF膜，4 ℃下添加一抗CGRP、NLRP3、ASC、caspase-1和β-actin抗體(均為1∶500)，孵育過夜。洗滌后添加羊抗鼠IgG二抗(稀釋比1∶5 000)常溫孵育2 h。以β-actin為內(nèi)參，采用Tanon 600圖像分析系統(tǒng)分析CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1蛋白水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠建模前后機(jī)械痛閾值比較

建模前3 d，各組大鼠機(jī)械痛閾值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；建模后1、3 d，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠機(jī)械痛閾值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而模型組和鹽酸小檗堿低、中及高劑量組大鼠兩兩比較的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；建模后5～14 d，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠機(jī)械痛閾值降低，與模型組比較，鹽酸小檗堿低、中及高劑量組大鼠機(jī)械痛閾值依次升高，呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠建模前后機(jī)械痛閾值比較Tab 2 Comparison of mechanical pain threshold among four groups

2.2 鹽酸小檗堿對(duì)大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織中IL-1β和TNF-α含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織中IL-1β、TNF-α含量明顯升高；與模型組比較，鹽酸小檗堿低、中及高劑量組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織中IL-1β、TNF-α含量依次降低，呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織中IL-1β、TNF-α含量比較Tab 3 Comparison of IL-1β and TNF-α in trigeminal ganglion tissues among four groups ng/L)

2.3 鹽酸小檗堿對(duì)大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織中CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA、蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織中CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高；與模型組比較，鹽酸小檗堿低、中及高劑量組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織中CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1 mRNA表達(dá)水平依次降低，呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織中CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1蛋白表達(dá)水平顯著升高；與模型組比較，鹽酸小檗堿低、中及高劑量組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織中CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1蛋白表達(dá)水平依次降低，呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表5、圖1。

表4 各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織中CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA表達(dá)水平比較Tab 4 Comparison of expression levels of mRNA in CGRP, NLRP3, ASC, and caspase-1 in trigeminal ganglion tissues among four groups

表5 各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織中CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1的蛋白表達(dá)水平比較Tab 5 Comparison of expression levels of protein in CGRP, NLRP3, ASC and caspase-1 in the trigeminal ganglion tissues among four groups

A.假手術(shù)組；B.模型組；C.鹽酸小檗堿低劑量組；D.鹽酸小檗堿中劑量組；E.鹽酸小檗堿高劑量組A. sham operation group; B. model group; C. low-dose group of berberine hydrochloride; D. medium-dose group of berberine hydrochloride; E. high-dose group of berberine hydrochloride圖1 WB法檢測(cè)各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織中CGRP、NLRP3、ASC及caspase-1的蛋白表達(dá)情況Fig 1 Expression levels of protein in CGRP, NLRP3, ASC and caspase-1 in trigeminal ganglion tissues detected by WB

3 討論

TN是神經(jīng)病理性疼痛，局部節(jié)段性脫髓鞘改變?yōu)槠渲饕±硖卣鱗11]。CGRP是一種舒張血管的神經(jīng)肽，對(duì)神經(jīng)節(jié)間的痛覺傳遞起重要作用，在中樞神經(jīng)、外周神經(jīng)和感覺神經(jīng)節(jié)內(nèi)均有表達(dá)[12-14]。CGRP受體由3個(gè)部分組成，分別為降鈣素受體樣受體、受體活性修飾蛋白1和受體組分蛋白。研究結(jié)果表明，CGRP與TN、顏面部疼痛、痛覺過敏和偏頭痛都有密切關(guān)系，但具體分子機(jī)制尚不清楚。本研究采用ION-CCI建立TN大鼠模型，該模型操作簡(jiǎn)單易行，能較好地模擬臨床三叉神經(jīng)受壓迫引起的痛覺超敏現(xiàn)象，結(jié)果顯示，建模前3 d和前1 d，各組大鼠機(jī)械痛閾值的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而建模后5～14 d，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠機(jī)械痛閾值顯著降低，且建模后第15日，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織中CGRP的mRNA、蛋白表達(dá)顯著升高，與以往研究結(jié)果相符[15-16]，說明TN大鼠模型制備成功。給予鹽酸小檗堿藥物處理后，與模型組比較，鹽酸小檗堿低、中及高劑量組大鼠機(jī)械痛閾值依次升高，三叉神經(jīng)節(jié)組織中CGRP的mRNA、蛋白表達(dá)依次降低且呈劑量依賴性，提示鹽酸小檗堿能降低三叉神經(jīng)節(jié)組織CGRP的mRNA、蛋白表達(dá)量，減少神經(jīng)節(jié)間的痛覺傳遞，增加TN大鼠機(jī)械痛閾值，在一定程度上保護(hù)大鼠免受TN帶來的傷害。

張學(xué)智等[17]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TN患者部分髓鞘受壓迫后變薄，與一般的神經(jīng)病變相似，可在三叉神經(jīng)病變中產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)、軸索變性、雪旺細(xì)胞增生和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等。三叉神經(jīng)節(jié)中炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子核因子κB(NF-κB)可誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的激活，該通路可進(jìn)一步促使機(jī)體釋放大量相關(guān)炎癥因子[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織中IL-1β、TNF-α含量顯著增高，提示NLRP3炎癥小體信號(hào)通路控制的炎癥因子IL-1β、TNF-α在TN發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。NLRP3炎癥小體是能夠參與機(jī)體固有免疫，覺察體內(nèi)微生物代謝物變化和應(yīng)激反應(yīng)，識(shí)別炎癥刺激信號(hào)，調(diào)控炎癥因子產(chǎn)生、釋放的蛋白復(fù)合物[19]。張婷等[20]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脊髓背角中IL-1β、TNF-α在神經(jīng)病理痛大鼠模型中起傳遞痛覺的作用。馬騰飛等[21]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)眶下孔注射相關(guān)炎癥因子IL-1β、TNF-α可制造大鼠TN模型。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿處理的大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織中IL-1β、TNF-α含量顯著依次降低，呈劑量依賴性，提示鹽酸小檗堿可減輕炎癥反應(yīng)。姜開洋等[22]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-1β、TNF-α在氣滯血瘀證原發(fā)性TN患者神經(jīng)節(jié)內(nèi)表達(dá)水平上調(diào)，與TN引起的炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織中NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA、蛋白表達(dá)水平均高于假手術(shù)組；與模型組比較，鹽酸小檗堿低、中及高劑量組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織中NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA、蛋白表達(dá)水平依次減少，呈劑量依賴性，提示鹽酸小檗堿可能通過抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路，減輕TN大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織中炎癥反應(yīng)，從而緩解TN大鼠的癥狀。

綜上所述，鹽酸小檗堿可能通過抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路，降低TN大鼠機(jī)械痛閾值以及神經(jīng)肽CGRP的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，從而減輕神經(jīng)節(jié)間的痛覺傳遞，進(jìn)而對(duì)TN大鼠起到一定的保護(hù)作用。