嚴(yán)海冬，繆文清，許巧欣，張志鵬，蔡延渠3,5,6#

(1.咸寧市中心醫(yī)院/湖北科技學(xué)院第一附屬醫(yī)院胃腸外科二病區(qū)，湖北 咸寧 437000； 2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 3.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣東 廣州 510006； 4.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100； 5.廣東省教育廳現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006； 6.國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑實(shí)驗(yàn)室(三級(jí))，廣東 廣州 510006)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)歸屬于非器質(zhì)性腸道功能紊亂性疾病，分為腹痛型、便秘型、腹瀉型和腹瀉便秘交替型，臨床常見伴有腹脹、腹痛、排便習(xí)慣和(或)大便性狀改變等癥狀，可持續(xù)或間歇發(fā)作[1]。隨著學(xué)習(xí)、工作和生活等壓力的增加，IBS發(fā)病率也呈現(xiàn)出逐年升高的趨勢[2]。但目前尚無治療IBS的特效藥，臨床上多是采取對癥進(jìn)行治療[3]。通過檢索中國知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，在特色中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下制定的方藥在臨床治療IBS疾病方面具有較為顯著的功效，常見的有寧腸湯[4]、白術(shù)芍藥散[5]、四逆散[6]、葛根芩連湯[7]、附子理中湯[8]、補(bǔ)中益氣湯[9]、柴術(shù)寧腸方[10]、風(fēng)芍六君子湯[11]、疏肝健脾方[12]、升陽益胃湯[13]、腸樂膠囊[14]以及和胃化濕片[15]等。通過分析處方組成發(fā)現(xiàn)，白術(shù)-白芍配伍是中醫(yī)臨床治療IBS腹痛、泄瀉的常用藥對，可起到補(bǔ)脾柔肝、扶土抑木之功效，在不同中藥處方配伍中均具有十分重要的意義[16]。同時(shí)檢索中國方劑數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，含白術(shù)和白芍的方劑共有1 557首，在治療腹痛腹瀉、嘔吐下痢及肝脾不和方面最為常見且療效最佳[17]。由于目前尚無白術(shù)-白芍配伍用于IBS的具體研究，因此，有必要對白術(shù)-白芍藥對的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制進(jìn)行更深入的探討與分析。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)立足于生物整體系統(tǒng)，進(jìn)行較為全面的網(wǎng)絡(luò)分析，通過選取相關(guān)信號(hào)節(jié)點(diǎn)對多靶點(diǎn)藥物進(jìn)行分子設(shè)計(jì)，強(qiáng)調(diào)多途徑調(diào)節(jié)信號(hào)通路，更能表現(xiàn)出中藥方劑的多靶點(diǎn)、多作用顯著特征，目前已嘗試用于預(yù)測中藥組方適用疾病和功效成分[18-19]。目前，在常用的數(shù)據(jù)庫中，中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)已收錄了500多種中藥以及30 069多個(gè)中藥化合物信息；中藥綜合數(shù)據(jù)庫(traditional Chinese medicines integrated database，TCMID)收載了47 000個(gè)中藥方劑、8 159種中藥及25 210個(gè)中藥化合物等信息；GeneCards數(shù)據(jù)庫可提供基因及其與疾病間關(guān)系等多種信息；治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD)收載了3 101個(gè)已上市或臨床研究階段藥物對應(yīng)的靶標(biāo)等信息；蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(UniProt)涵蓋了Swissprot、TrEMBL及PIR等3大數(shù)據(jù)庫信息，可分為UniProtKB、UniRef及UniParc 3大模塊，擁有最豐富的蛋白質(zhì)序列信息；String數(shù)據(jù)庫收錄了5 090個(gè)有機(jī)體及24 584 628種蛋白質(zhì)信息，其交互包括直接(物理)關(guān)聯(lián)和間接(功能)關(guān)聯(lián)；Metascape(基因注釋分析工具)匯聚了基因本體(gene ontology, GO)、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)、UniProt和DrugBank等數(shù)據(jù)庫資源數(shù)據(jù)，可進(jìn)行生物過程和通路富集的注釋、基因相關(guān)的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)分析以及相關(guān)藥物的分析[20]?；谝陨蠑?shù)據(jù)庫，本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析技術(shù)篩選出白術(shù)-白芍藥對中的潛在活性成分，同時(shí)對其作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測，闡釋白術(shù)-白芍配伍在治療IBS中的物質(zhì)基礎(chǔ)和起效機(jī)制，為其在臨床中的處方配伍應(yīng)用提供相關(guān)的理論參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 白術(shù)-白芍藥對中相關(guān)活性成分及其對應(yīng)基因靶點(diǎn)的篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、TCMID數(shù)據(jù)庫(http://www.megabionet.org/tcmid/)等數(shù)據(jù)庫中檢索中藥“白術(shù)”“白芍”化學(xué)成分；根據(jù)ADME原理，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)體現(xiàn)了藥物進(jìn)入人體后通過吸收再分布到臟器，進(jìn)而發(fā)生代謝及最后排泄的整體過程，類藥性(drug likeness，DL)體現(xiàn)了成分與已知藥物分子的相似性，故以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選調(diào)節(jié)，整理、分析和構(gòu)建白術(shù)-白芍藥對中關(guān)鍵活性成分的數(shù)據(jù)庫。同時(shí)，進(jìn)一步通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，逐一收集、統(tǒng)計(jì)關(guān)鍵活性成分的潛在蛋白靶點(diǎn)，再利用UniProt蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)校正靶點(diǎn)基因名。

1.2 IBS疾病靶點(diǎn)的收集

以“Irritable Bowel Syndrome”為關(guān)鍵詞，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、疾病相關(guān)的基因與突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(a database of gene-disease associations，DisGeNET，http://www.disgenet.org/home/)和TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)進(jìn)行檢索，整理、分析和構(gòu)建IBS疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。

1.3 白術(shù)-白芍藥對治療IBS的靶點(diǎn)交集

借助Venny 2.1在線繪制平臺(tái)(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)的分析功能，將白術(shù)-白芍藥對作用靶點(diǎn)與IBS疾病靶點(diǎn)進(jìn)行比對分析，選取交集靶點(diǎn)，整理、分析和構(gòu)建白術(shù)-白芍藥對治療IBS靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫。

1.4 “藥對-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將白術(shù)-白芍藥對、活性成分和交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)整理匯總，在Cytoscape 3.7.2軟件中導(dǎo)入數(shù)據(jù)，進(jìn)一步分析、構(gòu)建和繪制“藥對-活性成分-作用靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

整理交集靶點(diǎn)蛋白，將其以GENE SYMBOL格式上傳至String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，進(jìn)行PPI分析，物種參數(shù)設(shè)置為“Homo sapiens”，在軟件Cytoscape 3.7.2中導(dǎo)入數(shù)據(jù)，進(jìn)一步設(shè)置節(jié)點(diǎn)大小、顏色(反映連接度值Degree)，通過“Network analyze”功能對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，根?jù)Degree>中位數(shù)為條件篩選核心靶點(diǎn)。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

整理交集靶點(diǎn)，將其導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.html)，參數(shù)條件：設(shè)置選擇“OFFICE_GENE_SYMBOL”，物種限定為“Homo sapiens”，背景選擇“Homo sapiens”，進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，以P≤0.01為條件篩選出白術(shù)-白芍藥對治療IBS的生物過程及其相關(guān)通路。

2 結(jié)果

2.1 白術(shù)-白芍藥對的主要活性成分

通過數(shù)據(jù)庫檢索“白術(shù)”“白芍”，共獲得140個(gè)活性成分，其中白術(shù)55個(gè)，白芍85個(gè)。以O(shè)B≥30%且DL≥0.18進(jìn)一步篩選出活性較高成分20個(gè)，其中白術(shù)7個(gè)，白芍13個(gè)。白術(shù)-白芍藥對的主要活性成分見表1(以O(shè)B由高至低進(jìn)行排序)。

表1 白術(shù)-白芍藥對中活性成分的篩選Tab 1 Screening of active components of drug pair of rhizoma atractylodes macrocephala and radix paeoniae alba

2.2 白術(shù)-白芍藥對治療IBS的主要潛在靶點(diǎn)

通過檢索，“白術(shù)”“白芍”活性成分對應(yīng)的作用靶點(diǎn)分別為18、88個(gè)，合并去重后為89個(gè)作用靶點(diǎn)。對疾病數(shù)據(jù)庫以“Irritable bowel syndrome”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，分別從DisGeNET、drugbank、GeneCards、OMIM和TTD數(shù)據(jù)庫獲得429、139、1 000、485和27個(gè)IBS的疾病治療靶點(diǎn)，去重后獲得1 774個(gè)靶點(diǎn)。經(jīng)比對，白術(shù)-白芍藥對作用靶點(diǎn)與IBS的疾病靶點(diǎn)存在55個(gè)交集靶點(diǎn)，主要有AKT1、白細(xì)胞介素(IL)6、TNF、PTGS2、JUN、CAT、CASP3及NOS3等，見圖1。

圖1 白術(shù)-白芍藥對作用靶點(diǎn)與IBS疾病靶點(diǎn)的韋恩圖Fig 1 Wayne diagram of target of drug pair of rhizoma atractylodes macrocephala and radix paeoniae alba and disease target of IBS

2.3 “藥對-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

將白術(shù)-白芍藥對、活性成分與交集靶點(diǎn)信息通過軟件Cytoscape 3.7.2構(gòu)建“藥對-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，共包括個(gè)77節(jié)點(diǎn)和108條邊，見圖2。分析結(jié)果可知，山柰酚、β-谷甾醇、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮、兒茶素、8β-乙氧基白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、芍藥苷及谷甾醇具有最高的度值，作用的靶點(diǎn)數(shù)目分別為62、37、16、12、6、5及4。推測其可能是發(fā)揮藥效的主要活性成分。

圖2 白術(shù)-白芍“藥對-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Fig 2 “Drug pair-active components-effect target” network of drug pair of rhizoma atractylodes macrocephala and radix paeoniae alba

2.4 白術(shù)-白芍藥對治療IBS的關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，獲得相關(guān)信息后再通過Cytoscape 3.7.2軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。PPI網(wǎng)絡(luò)中顯示，節(jié)點(diǎn)55個(gè)，邊376條，平均節(jié)點(diǎn)度值(Degree)為13.67；其中，Degree>20的靶點(diǎn)有13個(gè)，其Degree由高至低排序依次為AKT1、IL-6、TNF、PTGS2、JUN、CAT、CASP3、NOS3、ESR1、HMOX1、AHR、PPARG和ICAM1，見圖3。

圖3 白術(shù)-白芍藥對關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)間相互作用的網(wǎng)絡(luò)分析Fig 3 Network analysis of protein-protein interaction of key targets of drug pair of rhizoma atractylodes macrocephala and radix paeoniae alba

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

對共同交集靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO功能分析和 KEGG通路富集分析(P<0.01)。GO功能富集分析共獲得47條生物功能顯著富集，其中，生物過程(biological process，BP)涉及有毒物質(zhì)、血液循環(huán)、有機(jī)環(huán)狀化合物、細(xì)胞增殖、活性氧代謝和細(xì)胞對氮化合物的反應(yīng)等；細(xì)胞成分(cell component，CC)涉及膜筏、突觸前膜的組成成分、核包膜、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、受體復(fù)合體和血液微粒等；分子功能(molecular function，MF)涉及G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、蛋白同源二聚活性、血紅素結(jié)合、核受體活性和銨離子結(jié)合等，見圖4。KEGG通路富集分析中，主要涉及的信號(hào)通路有癌癥途徑、鈣信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、鉑耐藥性以及cGMP-PKG信號(hào)通路等，見圖5。

圖5 白術(shù)-白芍藥對治療IBS關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析Fig 5 KEGG pathway enrichment analysis on key targets of drug pair of rhizoma atractylodes macrocephala and radix paeoniae alba in the treatment of IBS

3 討論

目前，關(guān)于IBS的具體病因和發(fā)病機(jī)制仍不明確，認(rèn)為其可能與遺傳因素、飲食因素、精神心理因素、內(nèi)臟高敏感、腦-腸軸調(diào)節(jié)異常、胃腸道動(dòng)力異常、腸道感染與免疫因素和腸道微生物群等有一定關(guān)系[21-22]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，獲得白術(shù)-白芍藥對中山柰酚、β-谷甾醇、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮及兒茶素等20個(gè)潛在的關(guān)鍵活性成分，與IBS疾病靶點(diǎn)間存在AKT1、IL-6、TNF、PTGS2、JUN、CAT、CASP3及NOS3等55個(gè)交集靶點(diǎn)。

其中，AKT1為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的基因編碼，可通過磷脂酰肌醇3激酶依賴的機(jī)制被胞外信號(hào)激活[23]。劉仕琦等[24]發(fā)現(xiàn)，七味白術(shù)散可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路上的IR、IRS-1、PI3K、Akt蛋白和mRNA的表達(dá)影響胰島素分泌，達(dá)到治療糖尿病的作用。IL-6與炎癥反應(yīng)具有密切關(guān)系，有文獻(xiàn)報(bào)道，IBS患者的IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著升高[25]；通過電針治療足三里，能夠使大鼠IBS模型的IL-6水平降低[26]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ能夠通過抑制一氧化氮的產(chǎn)生，抑制TNF-α、IL-6及血管內(nèi)皮生長因子活性，發(fā)揮抗炎作用[27]；山奈酚能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞 THP-1的MAPK通路的表達(dá)，減少M(fèi)DC、IP-10和IL-6等炎癥因子產(chǎn)生，從而有效消除炎癥[28]。此外，β-谷甾醇與豆甾醇也均可顯著抑制IL-10、IL-6等的表達(dá)，減少由DSS誘導(dǎo)引起的高炎表達(dá)[29]。caspase-3是一種蛋白酶M，可參與細(xì)胞凋亡、壞死和炎癥的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，已發(fā)現(xiàn)IBS患者血清中caspase-3、Bax表達(dá)增加而Bcl-2減少，可促進(jìn)神經(jīng)元凋亡[30]。劉綺等[31]發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可顯著上調(diào)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜成纖維樣滑膜細(xì)胞中Bax、caspase-3表達(dá)，抑制Bcl-2、IL-8等表達(dá)。

IBS患者在臨床上存在不同程度的腸道低度炎癥、免疫激活、黏膜屏障功能降低。通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)，白術(shù)-白芍藥對治療IBS的信號(hào)通路包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、癌癥信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、鉑耐藥性信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等。其中，AGE-RAGE信號(hào)通路是涉及炎癥反應(yīng)的主要調(diào)控信號(hào)通路之一。RAGE在炎癥反應(yīng)中起促炎癥介質(zhì)的作用，AGEs是RAGE的重要配體，可直接或通過作用其受體RAGE激活MG，誘導(dǎo)其釋放大量炎癥因子IL-1β和TNF-α[32]。芍藥總苷可通過改善類胰蛋白酶引起的腸上皮細(xì)胞屏障功能紊亂，降低內(nèi)臟的高敏感性，有效減緩腸易激的腹瀉和腹痛癥狀，并通過鈣離子信號(hào)通路發(fā)揮對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)或治療作用[33]。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ可能作用于CRH、轉(zhuǎn)化生長因子β1、SLC6A4、HTR2A及HTR3A等蛋白分子，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)或內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)通路來影響內(nèi)臟感覺傳遞和胃腸功能[34]。因此，推測白術(shù)-白芍藥對可能是通過AGE-RAGE信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路等途徑對IBS發(fā)揮治療作用。

此外，在進(jìn)一步的機(jī)制驗(yàn)證研究中，可先利用分子對接技術(shù)進(jìn)行理論驗(yàn)證，即將白術(shù)-白芍藥對中的關(guān)鍵活性成分山柰酚、3β-乙酰氧基、β-谷甾醇、兒茶素、8β-乙氧基白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、芍藥苷及谷甾醇等與AKT1、IL-6、TNF、PTGS2、JUN、CAT及CASP3等潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)通過autodock 4.2軟件進(jìn)行對接分析，以結(jié)合能<-5 kJ/mol為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)間的結(jié)合性，再借助PyMol 2.3.4軟件繪制成分與靶點(diǎn)對接模式圖，以輔助驗(yàn)證生信分析結(jié)果的可靠性。在綜合考慮理論分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，可通過致瀉法結(jié)合束縛法等建立IBS動(dòng)物(大鼠)模型，采用白術(shù)-白芍藥對及其有效活性成分(如山柰酚、β-谷甾醇、芍藥苷及白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ等)進(jìn)行藥物干預(yù)，通過Western-blot技術(shù)和Q-PCR技術(shù)對其AGE-RAGE信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白、基因(AKT1、IL-6、TNF及JUN等)的水平表達(dá)變化進(jìn)行檢測，以最終驗(yàn)證預(yù)測推論的準(zhǔn)確性。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了白術(shù)-白芍配伍治療IBS的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，理論上推測出白術(shù)-白芍藥對中山柰酚、β-谷甾醇、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮及兒茶素等活性成分通過作用于AKT1、IL-6、TNF及CASP3等靶點(diǎn)以調(diào)節(jié)AGE-RAGE信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路等而發(fā)揮治療IBS的作用。