翟官忠 劉澤林 王清華 柯帥 郭佳

腎癌是人類泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，男性和女性發(fā)病率約占全身惡性腫瘤的5%和3%[1]。手術(shù)可顯著延長早期腎癌患者的總生存期，但腎癌早期診斷困難，確診時約30%的患者已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。近30%～35%的局限性和局部進展期腎癌患者術(shù)后最終會再次復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差[2]。靶向治療可以顯著改善晚期和轉(zhuǎn)移性腎癌患者的預(yù)后，但靶向治療中的耐藥性問題，尚無有效的解決方案[3]。因此，尋找一種新的腎癌生物標志物或治療靶點對其早期診斷和治療具有重要意義。近年來，越來越多的微小RNA(miRNA)被發(fā)現(xiàn)在腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，且與腫瘤細胞的分化、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡密切相關(guān)[4]。最新報道顯示miR-520a-3p在胃癌、卵巢癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達下調(diào)，并影響其細胞的生物學(xué)行為[5-7]。關(guān)于miR-520a-3p在腎癌細胞中的表達情況，以及對腎癌細胞生物學(xué)行為的影響，尚未見相關(guān)報道。本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(qRT-PCR)檢測miR-520a-3p在腎癌細胞中的表達水平，通過轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-520a-3p的表達，觀察miR-520a-3p對腎癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響，檢測相關(guān)蛋白表達量變化，并利用生物信息學(xué)軟件和雙熒光素酶報告實驗檢測其相關(guān)靶標。

材料與方法

一、材料

正常腎小管上皮細胞HK2和腎癌細胞系786-O、A498、OS-RC-2及ACHN購自武漢普諾賽公司；RPIM-1640、PBS、Opti-MEM培養(yǎng)液和胰酶購自杭州吉諾公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；miR-520a-3p模擬物、陰性對照序列(miR-NC)、Bcl3-野生型(WT)質(zhì)粒、Bcl3-突變型(MUT)質(zhì)粒和引物購自廣州銳博公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；qRT-PCR相關(guān)試劑盒和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海翌圣公司；CCK-8試劑盒購自武漢塞維爾公司；Traswell小室購自美國Corning公司；Annexin V-PE/7-AAD凋亡試劑盒和Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。

二、細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

復(fù)蘇后的HK2、A498、OS-RC-2、786-O和ACHN細胞用RPIM-1640完全培養(yǎng)液(含10%的胎牛血清和1%青-鏈霉素)在含5%、CO2的37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞布滿培養(yǎng)皿80%的時候用含EDTA的胰酶消化傳代。將腎癌細胞786-O和A498各分為對照組、實驗組。對照組轉(zhuǎn)染miR-NC，實驗組轉(zhuǎn)染miR-520a-3p模擬物，按照Lipofectamine 2000說明書進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后進行相關(guān)實驗。

三、qRT-PCR

采用Trizol法提取腎癌細胞總RNA，Nanodrop 2000C儀檢測總RNA濃度及純度，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用PCR試劑盒于實時熒光定量儀上行擴增檢測。以U6為內(nèi)參檢測miR-520a-3p表達水平。U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-520a-3p上游引物：5′-CTGTGACCCTCCAGAGGGAAGTA-3′，下游引物5′-ACCGAAACAGTCCAAAGGGAAG-3′。采用2-△△ Ct法分析miR-520a-3p在腎癌細胞中相對表達水平。

四、細胞增殖實驗

使用CCK-8法檢測腎癌細胞活力。將各組細胞胰酶消化、離心重懸后，加入96孔板中，毎孔加入100 μl細胞懸液(約1×104個細胞)，置于培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)內(nèi)分別培養(yǎng)1、2、3、4 d，隨后加入10 μl CCK-8試劑，孵育2 h后于酶標儀下測定毎孔在450 nm處的吸光度(OD)值。

五、細胞遷移和侵襲實驗

遷移實驗：將各組細胞采用胰酶消化、離心，使用無血清1640培養(yǎng)液重懸后，將200 μl(約5×104個細胞)加入到Transwell 上室，并將600 μl 含10% FBS 1640培養(yǎng)液加入下室中，置于培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)培養(yǎng)24 h。然后用4%多聚甲醛固定液固定10 min。用棉簽輕擦除去上室殘留細胞，0.2%結(jié)晶紫染色10 min，PBS清洗后自然風(fēng)干，將小室倒置于倒置顯微鏡下觀察拍照，隨機選取10個視野計算平均細胞數(shù)。侵襲實驗：把80 μl Matrigel基質(zhì)膠和無血清培養(yǎng)液以1∶8比例配置的混合物加入到Transwell上室，放置培養(yǎng)箱中2～4 h。后續(xù)步驟同遷移實驗。

六、細胞凋亡實驗

使用不含EDTA的0.25%的胰酶消化細胞，并注意收集懸浮細胞，離心后使用預(yù)冷的PBS 潤洗 2 次，然后加入稀釋的結(jié)合緩沖液1 ml，PE 和7-ADD各 5 μl。避光孵育 15 min 后上流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。

七、Western blotting檢測目的蛋白表達量

轉(zhuǎn)染48 h后，使用細胞裂解液收集各組細胞總蛋白，并上樣至十二烷基酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，待電泳結(jié)束將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)封閉，一抗、二抗孵育，ECL化學(xué)發(fā)光液顯色后，使用Odyssey檢測目的蛋白表達量。

八、生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-520a-3p靶基因及雙熒光素酶報告實驗

通過生物信息學(xué)軟件PicTar預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-520a-3p和Bcl3存在可結(jié)合位點。隨后將miR-520a-3p模擬物或miR-NC和Bcl3-WT、Bcl3-MUT共轉(zhuǎn)染至腎癌細胞系786-O和A498中，各分為4組： miR-NC+Bcl3-WT、miR-520a-3p+Bcl3-WT、miR-NC+Bcl3-MUT和miR-520a-3p+Bcl3-MUT組。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。以海腎熒光素酶基因作為內(nèi)參基因，螢火蟲熒光素酶作為報告基因，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

九、統(tǒng)計學(xué)方法

使用Graphpad Prim 8軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各腎癌細胞系中miR-520a-3p的表達水平

通過qRT-PCR檢測miR-520a-3p在腎癌細胞系中的表達水平，結(jié)果顯示，對比正常腎小管上皮細胞，miR-520a-3p在各腎癌細胞系中的表達水平均降低(P<0.05)。在786-O、A498細胞中降低最明顯(P<0.05)，因此采用786-O和A498細胞進行后續(xù)實驗。見圖1。

圖1 miR-520a-3p在HK2細胞和各腎癌細胞系中的表達水平(與HK2細胞相比 *P<0.05)

二、轉(zhuǎn)染miR-520a-3p模擬物后各組腎癌細胞miR-520a-3p的表達水平

通過qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-520a-3p表達水平，結(jié)果顯示，miR-520a-3p在 786-O細胞中對照組和實驗組的表達水平分別為(1.13±0.12)和(486.20±56.37)，P<0.05；在A498細胞中對照組和實驗組的表達水平分別為(1.09±0.18)和(517.30±62.51)，P<0.05。實驗組miR-520a-3p表達水平明顯上升。見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染后各組786-O和A498細胞中miR-520a-3p的表達水平(與對照組相比 *P<0.05)

三、轉(zhuǎn)染miR-520a-3p模擬物后對腎癌細胞增殖能力的影響

使用CCK-8法連續(xù)測定4 d各組細胞的OD值，然后繪制成圖。結(jié)果顯示，在786-O和A498兩種細胞系中，與對照組相比，實驗組細胞在第3、4天活力明顯受到抑制(P<0.05)。見圖3。

圖3 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后各組786-O和A498細胞的OD值變化(與對照組相比 *P<0.05)

四、轉(zhuǎn)染miR-520a-3p模擬物后對腎癌細胞遷移能力的影響

Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，786-O細胞中對照組和實驗組遷移細胞數(shù)分別為(205.76±8.37)和(113.83±6.45)個，P<0.05；A498細胞中對照組和實驗組遷移細胞數(shù)分別為(193.52±9.46)和(97.49±5.73)個，P<0.05。實驗組遷移細胞數(shù)明顯下降。見圖4。

圖4 Transwell小室檢測轉(zhuǎn)染后786-O和A498細胞的遷移變化(與對照組相比 *P<0.05)

五、轉(zhuǎn)染miR-520a-3p模擬物后對腎癌細胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，786-O細胞中對照組和實驗組侵襲細胞數(shù)分別為(175.31±4.13)和(74.67±4.29)個，P<0.05；A498細胞中對照組和實驗組侵襲細胞數(shù)分別為(194.89±7.61)和(81.13±6.24)個，P<0.05。實驗組侵襲細胞數(shù)明顯下降。見圖5。

圖5 Transwell小室檢測轉(zhuǎn)染后786-O和A498細胞的侵襲變化(與對照組相比 *P<0.05)

六、轉(zhuǎn)染miR-520a-3p模擬物后對腎癌細胞凋亡水平的影響

流式細胞術(shù)測定結(jié)果顯示，786-O細胞中對照組和實驗組凋亡率分別為(8.69±0.86)%、(21.75±1.96)%，P<0.05；A498細胞中對照組和實驗組凋亡率分別為(7.71±0.84)%、(19.73±1.27)%，P<0.05。實驗組細胞凋亡水平明顯升高。見圖6。

圖6 流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后786-O和A498細胞的凋亡水平(與對照組相比 *P<0.05)

七、轉(zhuǎn)染miR-520a-3p模擬物后腎癌細胞N-cadherin、E-cadherin、Bcl2、Bcl3蛋白表達量

Western blotting結(jié)果顯示，與對照組相比，兩實驗組細胞N-cadherin、Bcl2、Bcl3蛋白表達量均明顯降低，E-cadherin蛋白表達量均明顯增高。見圖7。

圖7 Western blotting檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞N-cadherin、E-cadherin、Bcl2和Bcl3蛋白表達量

八、miR-520a-3p靶基因預(yù)測與驗證

使用PicTar預(yù)測分析miR-520a-3p靶基因，結(jié)果表明miR-520a-3p與Bcl3存在可結(jié)合位點(圖8)。進一步使用雙熒光素酶報告實驗驗證，結(jié)果顯示，miR-520a-3p模擬物和Bcl3-WT共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性明顯低于miR-NC和Bcl3-WT共轉(zhuǎn)染組[786-O：(0.22±0.06)vs(1.00±0.03)，P<0.05)；A498：(0.27±0.03)vs(1.00±0.04)，P<0.05)]；miR-520a-3p模擬物或miR-NC和Bcl3-MUT共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。見圖9。

圖8 miR-520a-3p和Bcl3結(jié)合位點預(yù)測

圖9 雙熒光素酶基因報告檢測miR-520a-3p模擬物與Bcl3-WT/MUT共轉(zhuǎn)染后786-O和A498細胞的熒光素酶活性(與miR-NC組相比 *P<0.05)

討 論

miRNA是一種大小約為22個核苷酸的非編碼RNA，通過堿基互補配對以完全或不完全方式靶向mRNA，影響靶基因mRNA的翻譯水平，其異常表達在癌癥的發(fā)生和進展中起著至關(guān)重要的作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-520a-3p在多種惡性腫瘤中低表達，并發(fā)揮著抑癌基因作用[5-7, 9-12]。為了研究miR-520a-3p在腎癌細胞中表達情況，本研究通過qRT-PCR對比HK2和多種腎癌細胞系中miR-520a-3p表達水平，發(fā)現(xiàn)miR-520a-3p在腎癌細胞中低表達。

多項研究表明上調(diào)miR-520a-3p表達可影響腫瘤細胞的生物學(xué)行為。上調(diào)腫瘤細胞中miR-520a-3p表達后，胃癌細胞增殖能力明顯降低[5]；卵巢癌細胞增殖和侵襲能力明顯降低，細胞凋亡率明顯上升[6]；乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力顯著降低，細胞凋亡率顯著上升[7]。為了探究miR-520a-3p對腎癌細胞的影響，我們通過轉(zhuǎn)染miR-520a-3p模擬物上調(diào)腎癌細胞系786-O和A498中miR-520a-3p的表達，發(fā)現(xiàn)腎癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯受抑制，細胞凋亡率上升。我們通過Western blotting驗證786-O和A498中相關(guān)蛋白變化，發(fā)現(xiàn)N-cadherin和Bcl2蛋白表達量均明顯降低，E-cadherin蛋白表達量均明顯增高，已有研究證明，N-cadherin和E-cadherin的異常表達與腫瘤的遷移和侵襲密切相關(guān)[13-14]，Bcl2可通過調(diào)節(jié)線粒體外膜的通透性，將凋亡因子釋放到細胞質(zhì)中，從而誘導(dǎo)細胞凋亡[15]，提示miR-520a-3p可通過調(diào)控腎癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡進程而參與腎癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

近期不斷有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-520a-3p可負向調(diào)控腫瘤高表達基因，進而影響腫瘤細胞的生物學(xué)行為。Bi等[10]發(fā)現(xiàn)，miR-520a-3p通過下調(diào)JAK1表達，抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖、遷移和侵襲，促進其凋亡。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)miR-520a-3p通過下調(diào)LIMK1表達，抑制肝癌細胞的生物學(xué)行為。Liu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-520a-3p通過下調(diào)HOXD8表達，抑制非小細胞肺癌細胞的生長和癌癥干細胞的表型。為了進一步研究miR-520a-3p在腎癌中的作用靶點，我們通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)Bcl3可能是miR-520a-3p的靶基因。Bcl3在前期已被證實是B細胞慢性淋巴細胞白血病中的原癌基因[16]，最新研究表明，其在多種實體腫瘤中高表達，并通過多種信號通路影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[17-19]。 Dai等[20]通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Bcl3在腎癌組織中高表達，Bcl3的高表達與患者不良預(yù)后密切相關(guān)。本研究通過雙熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)，miR-520a-3p可直接靶向Bcl3，并通過Western blotting 進一步證實轉(zhuǎn)染miR-520a-3p模擬物后Bcl3蛋白表達含量明顯降低。我們下一步擬通過干擾腎癌細胞中miR-520a-3p和Bcl3的表達，研究miR-520a-3p與Bcl3調(diào)控關(guān)系及相關(guān)通路。

綜上所述，miR-520a-3p在腎癌細胞系中表達水平顯著降低。在腎癌細胞系786-O和A498中，過表達miR-520a-3p可抑制其增殖、遷移和侵襲能力，促進細胞凋亡。Bcl3是miR-520a-3p的靶基因之一。本研究結(jié)果提示miR-520a-3p可能在腎癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，探討miR-520a-3p的調(diào)控機制可能為研究腎癌發(fā)生、發(fā)展提供新的思路。