張春雷 楊琦 周逢海 徐東波 康亞芬 常德輝

CDR1as(又稱(chēng)ciRS-7，hsa_circ_0001946)已被證明在包括肝細(xì)胞癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌等[1]在內(nèi)的多種腫瘤疾病中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用，在膀胱癌中通過(guò)CDR1as-miR-7-p21/CDR1as-miR1270途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[2]。CDR1as是目前研究廣泛及功能強(qiáng)大的環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)，然而其在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用目前尚無(wú)論證，我們通過(guò)對(duì)34例前列腺癌患者術(shù)后標(biāo)本的癌及癌旁配對(duì)組織樣本進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)CDR1as在前列腺癌組織中顯著低表達(dá)，說(shuō)明CDR1as可能在前列腺癌的疾病發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，對(duì)此，我們通過(guò)基因檢測(cè)結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)分析，探索CDR1as在前列腺癌中可能的作用及機(jī)制。

材料與方法

一、前列腺癌患者組織標(biāo)本獲取及測(cè)序

選取就診于中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院術(shù)后病理診斷為前列腺癌患者的腫瘤組織及癌旁組織(已通過(guò)醫(yī)院倫理審核，審批編號(hào)：2020KYLL030)，一部分留作提取RNA，一部分送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，差異分析采用edgeR分析方法，差異表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)為Fold change>2.0 且P值<0.05，細(xì)胞測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)與之相同。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞接種于含有4 ml(10%胎牛血清)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，放于37 ℃、5% CO2條件下的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。RWPE1細(xì)胞培養(yǎng)在PEpiCM培養(yǎng)液中，LNCap細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)液中，PC3細(xì)胞培養(yǎng)在F-12(ham)培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液每2天更換一次，細(xì)胞在生長(zhǎng)到70%～80% 時(shí)用0.5 ml 0.25% 的胰蛋白酶/ EDTA室溫下消化并傳代。

三、siRNA干擾處理

常規(guī)消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，在6孔板中預(yù)鋪1×105個(gè)細(xì)胞，1 d后至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，使用預(yù)熱的OPTI-MEM配置轉(zhuǎn)染試劑懸液和10 mmol/L干擾RNA(siRNA)懸液，按照說(shuō)明書(shū)將混勻的轉(zhuǎn)染試劑溶液滴加到培養(yǎng)液中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。siRNA1：GCACCTGTGTCAAGGTCTTTT；siRNA2：GGT-CTTCCAGCGACTTCAATT；siRNA3：GTGCTGATCTTCTGACATTTT。

四、RNA提取

將組織在液氮中磨碎，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理后采用Trizol法常規(guī)提取RNA；將培養(yǎng)貼壁細(xì)胞用PBS清洗2遍，之后采用Trizol法常規(guī)提取RNA。

五、反轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript?RT Master Mix試劑，Takara，中國(guó))提供的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行配置，放至PCR儀，按照37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；按照RT-qPCR試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTM試劑，Takara，中國(guó))提供的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行配置，放入儀器中，采用兩步法RT-qPCR的默認(rèn)設(shè)定程序進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品做3次重復(fù)。引物如下：CDR1as(F：CGTCTCCAGTGTGCTGATCT；R：GTCCGGAAGACATGGATT)，β-actin(F：CGC-GAGAAGATGCCCAGATC；R：TCACCGGAGT-CCATCACG)。

六、CDR1as作用機(jī)制的預(yù)測(cè)

采用miRanda軟件預(yù)測(cè)CDR1as與miRNA結(jié)合位點(diǎn)，利用癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中的臨床數(shù)據(jù)信息，分析差異表達(dá)的基因?qū)η傲邢侔╊A(yù)后的影響，通過(guò)circinteractome網(wǎng)站(https://circinteractome.nia.nih.gov/)預(yù)測(cè)CDR1as是否與蛋白質(zhì)存在結(jié)合位點(diǎn)，利用ORF Finder網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測(cè)CDR1as是否擁有開(kāi)放閱讀框(open reading frames, ORF)及IRESite網(wǎng)站(http://iresite.org/IRESite_web.php)預(yù)測(cè)是否具有內(nèi)在的核糖體進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)(internal ribosome entry site, IRES)。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，采用Pearson相關(guān)性分析預(yù)測(cè)基因與CDR1as表達(dá)的相關(guān)性及利用生存分析進(jìn)行預(yù)后分析，癌與癌旁組織中表達(dá)差異變化采用表達(dá)量差值進(jìn)行分析(T-N)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、CDR1as在前列腺癌患者組織及前列腺癌相關(guān)細(xì)胞系中的表達(dá)情況

在34例前列腺癌患者術(shù)后標(biāo)本的配對(duì)樣本中，CDR1as在癌組織中表達(dá)量顯著低于癌旁組織(P<0.05，圖1A)；為驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，選取17例前列腺癌患者術(shù)后標(biāo)本的癌及癌旁配對(duì)組織樣本進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，結(jié)果表明，在3組配對(duì)的組織樣本中，CDR1as在癌組織中的表達(dá)量高于癌旁組織，在其余的14組配對(duì)組織樣本中，癌組織中的表達(dá)量均低于癌旁組織，CDR1as在癌組織中的表達(dá)量低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1B、1C)。相比于前列腺正常上皮細(xì)胞系RWPE1，CDR1as在前列腺癌細(xì)胞系PC3中高表達(dá)，在LNCap中低表達(dá)(P<0.05)。

二、篩選被CDR1as調(diào)控的下游靶基因

為篩選在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中可能被CDR1as調(diào)控的下游靶基因，采用3種CDR1as的siRNA對(duì)表達(dá)量升高的PC3細(xì)胞進(jìn)行處理，模擬腫瘤組織中CDR1as表達(dá)下調(diào)，收集處理過(guò)的細(xì)胞進(jìn)行mRNA測(cè)序，取3組處理細(xì)胞測(cè)序結(jié)果中同時(shí)上調(diào)或下調(diào)的mRNA，并選取與組織測(cè)序結(jié)果中差異表達(dá)mRNA變化趨勢(shì)一致的mRNA。結(jié)果表明經(jīng)過(guò)siRNA處理后，3組PC3細(xì)胞中的CDR1as表達(dá)量均下調(diào)(圖2A)，與對(duì)照組相比，測(cè)序的3組配對(duì)樣本中共有225個(gè)顯著上調(diào)的mRNA和228個(gè)顯著下調(diào)的mRNA，組織測(cè)序結(jié)果中共有401個(gè)顯著上調(diào)的mRNA、1 010個(gè)顯著下調(diào)的mRNA，共篩選出7個(gè)顯著上調(diào)的mRNA和37個(gè)顯著下調(diào)的mRNA作為在前列腺癌發(fā)生及發(fā)展中被CDR1as調(diào)控的下游靶基因(圖2B)。

A：34例前列腺癌患者術(shù)后標(biāo)本的癌及癌旁配對(duì)組織樣本中CDR1as測(cè)序表達(dá)量對(duì)比；B、C：17例前列腺癌患者腫瘤組織與癌旁組織CDR1as表達(dá)量的RT-qPCR驗(yàn)證；D：CDR1as在3種前列腺癌相關(guān)細(xì)胞系中的表達(dá)圖1 CDR1as在前列腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)量(*P<0.05，**P<0.01)

A：PC3細(xì)胞中采用3種siRNA干擾處理后CDR1as表達(dá)量；B：篩選組織測(cè)序結(jié)果及PC3細(xì)胞采用3種siRNA干擾處理后測(cè)序結(jié)果中差異表達(dá)變化趨勢(shì)一致的mRNA 圖2 被CDR1as調(diào)控的下游靶基因的篩選

三、探索CDR1as與差異表達(dá)基因的相關(guān)性

采用Pearson相關(guān)性分析組織測(cè)序結(jié)果， 探索腫瘤組織中與CDR1as表達(dá)變化存在相關(guān)性的基因，并對(duì)這些基因在癌與癌旁組織中表達(dá)差異變化與CDR1as在癌與癌旁組織中表達(dá)差異變化(用表達(dá)量差值表示)是否存在相關(guān)性進(jìn)行檢測(cè)，表1列舉了與前列腺癌或其他惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展存在相關(guān)性的基因，共有19個(gè)基因在前列腺癌患者腫瘤組織中與CDR1as表達(dá)變化存在相關(guān)性，其中表達(dá)上調(diào)的為BIRC5和PRDX4，表達(dá)下調(diào)的為RASGRP2、MRVI1、RUNX1T1、CD200、RARRES2、ASPA、CD69、RGS22、GSTM5、LRP4、ASXL3、MYO1F、CCL5、FBLN2、PRRX2、ACOX2和INPP5D；共有12個(gè)基因在癌與癌旁組織中表達(dá)差異變化與CDR1as表達(dá)差異變化存在相關(guān)性，其中表達(dá)上調(diào)的為PRDX4，表達(dá)下調(diào)的為MRVI1、RUNX1T1、CD200、RARRES2、ASPA、GSTM5、LRP4、FBLN2、PRRX2、ACOX2和INPP5D(P<0.05)。采用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的臨床數(shù)據(jù)信息，分析差異表達(dá)的基因?qū)η傲邢侔╊A(yù)后的影響，結(jié)果表明低表達(dá)的GSTM5與前列腺癌不良預(yù)后有關(guān)(P<0.05，圖3)。

圖3 GSTM5表達(dá)對(duì)前列腺癌患者預(yù)后分析

表1 在前列腺癌患者組織中與CDR1as表達(dá)變化趨勢(shì)存在相關(guān)性的mRNA

四、預(yù)測(cè)CDR1as與miRNA結(jié)合位點(diǎn)

為進(jìn)一步探索CDR1as在前列腺癌發(fā)生及發(fā)展中可能的作用機(jī)制，采用miRanda軟件預(yù)測(cè)CDR1as與miRNA結(jié)合位點(diǎn)，共檢測(cè)出CDR1as與68個(gè)miRNA存在結(jié)合位點(diǎn)，存在5個(gè)以上結(jié)合位點(diǎn)的miRNA為hsa-miR-7-5p、hsa-miR-3617-5p、hsa-miR-8056、hsa-miR-641、hsa-miR-1290、hsa-miR-1246、hsa-miR-3156-5p、hsa-miR-139-3p及hsa-miR-3167(圖4)。

圖4 miRanda軟件預(yù)測(cè)CDR1as與miRNA結(jié)合位點(diǎn)

五、預(yù)測(cè)CDR1as是否與蛋白質(zhì)相互作用或翻譯蛋白的可能性

circRNA可以與蛋白質(zhì)相互結(jié)合或翻譯蛋白而發(fā)揮作用，通過(guò)circinteractome網(wǎng)站預(yù)測(cè)CDR1as是否與蛋白質(zhì)存在結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果表明CDR1as序列與蛋白質(zhì)無(wú)結(jié)合位點(diǎn)，反向剪接位點(diǎn)與IGF2BP2存在結(jié)合位點(diǎn)，其側(cè)翼序列與FUS、IGF2BP2、IGF2BP3存在結(jié)合位點(diǎn)(表2)。為探索circRNA是否具有翻譯蛋白質(zhì)的潛能，利用ORF Finder網(wǎng)站及IRES網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示CDR1as具有14個(gè)ORF(表3)及8個(gè)IRES(表4)。

表2 CDR1as與蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

表3 CDR1as ORF預(yù)測(cè)

表4 CDR1as IRES預(yù)測(cè)

討 論

CDR1as具有1 485個(gè)堿基，它是由CDR1反義鏈環(huán)化形成的circRNA，其序列具有豐富的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，不但種類(lèi)多，而且與多個(gè)miRNA具有5個(gè)以上的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，預(yù)示著其miRNA海綿作用機(jī)制功能強(qiáng)大，miRanda軟件預(yù)測(cè)其與miRNA結(jié)合位點(diǎn)證明了這一點(diǎn)。通過(guò)對(duì)34例前列腺癌患者術(shù)后標(biāo)本的癌及癌旁配對(duì)組織樣本測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDR1as在前列腺癌組織中顯著低表達(dá)，CDR1as在另外17例前列腺癌患者的癌及癌旁配對(duì)組織標(biāo)本中的RT-qPCR表達(dá)量也驗(yàn)證了測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，表明其可能在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步探索其潛在作用和可能的作用機(jī)制，我們通過(guò)測(cè)序及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方式篩選出可能被CDR1as影響表達(dá)的候選基因，根據(jù)候選基因的功能推測(cè)CDR1as在前列腺癌疾病中的作用。PRDX4是篩選出的與CDR1as在前列腺癌患者組織中變化相關(guān)且在前列腺癌組織中上調(diào)的基因，前列腺癌組織中PRDX4過(guò)表達(dá)，并促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖[3]，但下調(diào)的CDR1as如果通過(guò)miRNA海綿機(jī)制發(fā)揮作用，理論上PRDX4在前列腺癌組織中受到miRNA作用會(huì)出現(xiàn)下調(diào)，說(shuō)明CDR1as可能通過(guò)其他途徑調(diào)節(jié)PRDX4，比如與長(zhǎng)鏈非編碼RNA等相互協(xié)調(diào)共同發(fā)揮作用。其他與CDR1as變化顯著相關(guān)的幾個(gè)基因主要發(fā)揮抑癌作用，比如miR-940通過(guò)下調(diào)MRVI1促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的增殖和轉(zhuǎn)移[4]，RUNX1T1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)化療藥物抵抗[5]，ASPA、PRRX2和GSTM5在前列腺癌組織中顯著下調(diào)[6-7]，F(xiàn)BLN2在鼻咽癌中發(fā)揮抗血管生成和腫瘤抑制作用[8]，ACOX2在心臟惡性腫瘤中表達(dá)缺乏[9]，INPP5D作為抑癌基因p53的下游靶基因，在多個(gè)腫瘤中的缺氧誘導(dǎo)調(diào)控過(guò)程起到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[10]，而且低表達(dá)的GSTM5與前列腺癌不良預(yù)后有關(guān)。如果前列腺癌腫瘤組織中低表達(dá)的CDR1as導(dǎo)致這些發(fā)揮抑癌作用的基因表達(dá)降低，那么其發(fā)揮促腫瘤作用的機(jī)制可能是通過(guò)這些基因?qū)崿F(xiàn)的，這些基因表達(dá)的下調(diào)也證明CDR1as的表達(dá)下降可能是前列腺癌疾病進(jìn)展的因素。

腫瘤微環(huán)境是調(diào)節(jié)腫瘤疾病進(jìn)展的重要因素，而免疫調(diào)節(jié)在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。在與CDR1as表達(dá)變化顯著相關(guān)的基因中，RARRES2表達(dá)的蛋白是一種內(nèi)源性白細(xì)胞趨化劑，可通過(guò)其受體ChemR23募集先天免疫細(xì)胞。在腫瘤微環(huán)境中增強(qiáng)RARRES2可以部分抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞的募集，從而顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，升高的RARRES2可以通過(guò)增加PTEN的表達(dá)及降低PD-L1的表達(dá)顯著抑制前列腺癌細(xì)胞系DU145的成瘤作用[11]，說(shuō)明 RARRES2表達(dá)的下調(diào)也是前列腺癌進(jìn)展的可能因素之一。另外，腫瘤特異性TH1細(xì)胞在抗癌免疫反應(yīng)中也起到重要作用，CD200和CD69是腫瘤特異性CD4+T細(xì)胞表面特異性分子[12]，兩者表達(dá)的下降是否意味著下調(diào)的CDR1as也影響著腫瘤特異性T細(xì)胞的表達(dá)，進(jìn)而影響其抗腫瘤的功能，值得進(jìn)一步探索。

當(dāng)然，這些與CDR1as表達(dá)密切相關(guān)的下調(diào)基因也有發(fā)揮促癌作用的基因，比如LRP4促進(jìn)胃癌及甲狀腺癌的發(fā)展[13-14]，F(xiàn)BLN2在肺腺癌中也是惡性進(jìn)展的促進(jìn)因子[15]。那么它們的下調(diào)意味著作為抑癌因素存在。此外，ASXL3、MYO1F和CCL5也是促癌基因[16-18]，尤其是有報(bào)道表明CCL5通過(guò)激活β-catenin/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)前列腺癌干細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[19]，但這些基因在腫瘤組織與癌旁組織中差異變化并未體現(xiàn)出與CDR1as表達(dá)差異變化存在相關(guān)性，說(shuō)明它們可能并非CDR1as調(diào)控。總體來(lái)說(shuō)，這些與CDR1as表達(dá)密切相關(guān)的基因主要以發(fā)揮抑癌作用的基因?yàn)橹鳌?/p>

除了miRNA海綿作用，circRNA還可以通過(guò)與蛋白質(zhì)相互作用，甚至翻譯蛋白發(fā)揮作用。雖然CDR1as是反義鏈circRNA，但如果其具備翻譯蛋白質(zhì)的必備條件，也有可能通過(guò)翻譯成蛋白質(zhì)發(fā)揮作用。已有研究表明CDR1as通過(guò)破壞P53/MDM2復(fù)合物從而限制P53蛋白的泛素化來(lái)促進(jìn)其穩(wěn)定性，最終達(dá)到抑制膠質(zhì)瘤的進(jìn)展[20]，因此CDR1as在前列腺癌中也可能通過(guò)與蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)制發(fā)揮功能。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)及分析，CDR1as具有14個(gè)ORF及8個(gè)IRES，那么其能否翻譯蛋白質(zhì)也是值得探索的。另外，CDR1as的剪接位點(diǎn)及側(cè)翼序列可能與FUS、IGF2BP2、IGF2BP3相結(jié)合，而FUS/TLS是前列腺癌細(xì)胞中雄激素受體的共激活因子，可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞系LNCap細(xì)胞的雄激素依賴(lài)性增殖[21]，IGF2BP3在前列腺癌組織中高表達(dá)，且與高Gleason評(píng)分相關(guān)[22]，下調(diào)的CDR1as可能因?yàn)閷?duì)FUS、IGF2BP2、IGF2BP3抑制作用減輕而發(fā)揮促腫瘤作用。

在進(jìn)行前列腺癌細(xì)胞系的CDR1as表達(dá)量驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)，前列腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞系PC3中CDR1as高表達(dá)，在LNCap細(xì)胞中低表達(dá)，考慮原因可能是細(xì)胞系為純化的細(xì)胞，導(dǎo)致其分子表達(dá)量與組織中表達(dá)量不一致，另外PC3細(xì)胞系并不能很好的作為前列腺癌研究模型，PC3細(xì)胞為骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞系，其基因表達(dá)與原位細(xì)胞系的基因表達(dá)差異比較大，但是CDR1as在骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中的高表達(dá)是否意味著隨著表達(dá)量的改變導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的發(fā)生也是將要探索的方向。這種現(xiàn)象也提示我們?cè)谘芯緾DR1as在前列腺癌疾病進(jìn)程中的作用應(yīng)選擇LNCap細(xì)胞模型?？傮w而言，通過(guò)對(duì)CDR1as在腫瘤組織中低表達(dá)以及CDR1as與差異表達(dá)基因的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,得出低表達(dá)的CDR1as可能促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展的結(jié)論，其具體功能有待進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)的鑒定，比如利用CDR1as低表達(dá)的LNCap細(xì)胞構(gòu)建CDR1as過(guò)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)株并檢測(cè)其生物學(xué)變化，以及CDR1as精確的作用機(jī)制等都有待進(jìn)一步探索。