崔宇 王曉坤 張燕 孫宏

AD是現(xiàn)階段世界范圍內(nèi)尚無確切治療方案的一種神經(jīng)退行性疾病[1]。AD前期多不易被發(fā)現(xiàn),或以輕度認(rèn)知功能障礙(mild cognitive impairment,MCI)被臨床所發(fā)現(xiàn),由于早期缺乏特異性診斷方法,導(dǎo)致其生存率較低[2]。

代謝組學(xué)是近些年才快速開展起來的組學(xué)研究,可通過研究早期潛在的代謝標(biāo)志物為生物系統(tǒng)提供完整、準(zhǔn)確、動(dòng)態(tài)的代謝網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)一步揭示生物體新陳代謝過程中代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，有助于全面理解疾病的變化過程和闡釋發(fā)病機(jī)制及體內(nèi)物質(zhì)代謝途徑等[3]。本研究旨在探討AD病人血液和尿液的代謝組學(xué)變化。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究對(duì)黑龍江省農(nóng)墾地區(qū)9個(gè)管理局的66家福利院共1862名≥65歲且未患過腦血管疾病的老年人進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查。根據(jù)有無AD將研究對(duì)象分為AD組和對(duì)照組。

AD組的納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥65歲；按照美國精神醫(yī)學(xué)會(huì)的《精神障礙診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》第4版(DSM-Ⅳ)標(biāo)準(zhǔn)診斷癡呆，采用美國國立神經(jīng)病語言障礙卒中研究所和阿爾茨海默病及相關(guān)疾病協(xié)會(huì)(NINCDS-ADRDA)標(biāo)準(zhǔn)診斷AD。

對(duì)照組的納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥65歲；現(xiàn)場調(diào)查者訪問和體檢過程中未發(fā)現(xiàn)認(rèn)知功能衰退或損害的征象，MMSE測試成績均在正常范圍內(nèi)。從已確定的AD組和對(duì)照組中隨機(jī)篩選出34例AD病人和31例健康老年人進(jìn)行檢測。本研究遵照《赫爾辛基宣言》的原則實(shí)施,研究對(duì)象均已知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 氨基酸自動(dòng)分析儀(L-8800，日本日立公司)；Quattro micro液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀， 混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(美國，Sigma公司)；甲酸(色譜純，北京Dikma公司)；乙腈(色譜純，北京Dikma公司)；甲醇(色譜純，北京Dikma公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血液及尿液的采集：采集血樣前3 d，給予受試對(duì)象相同飲食，加強(qiáng)樣本基礎(chǔ)質(zhì)控。于第4天清晨7:00～9:00時(shí)取空腹靜脈血5 mL，3000 r/min離心10 min，取上層血清，置于EP管中，-80 ℃低溫冰箱保存。

采集晨中段尿20 mL,收集于50 mL潔凈塑料管中， 3000 r/min室溫離心10 min,精確吸取4.0 mL尿樣上清液，置入5.0 mL潔凈的離心管中， 12 000 r/min，4 ℃，離心10 min；精確吸取2.0 mL分別置于1.5 mL潔凈的EP管中，每管1 mL,于-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 血清及尿液氨基酸分析 將血清及尿液樣品室溫條件下解凍。取0.5 mL血清、1.0 mL尿樣分別置于5.0 mL容量瓶中，分別加10%磺基水楊酸除蛋白，定容，混勻；用10 mol/L氫氧化鈉分別調(diào)pH至2.2；離心,取上清液分別置于EP管中，備檢。取上清液1.5 mL，過0.45μm水性微孔濾膜到上機(jī)進(jìn)樣瓶中，L-8800氨基酸分析儀分別檢測尿液和血清中17種游離氨基酸含量。

1.3.3 尿樣超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析

1.3.3.1 樣品前處理及檢測:將尿液樣品室溫下解凍。12 000 r/min轉(zhuǎn)速于4 ℃下，離心10 min，取上清300μL，加入300μL雙蒸水稀釋，渦旋混勻，轉(zhuǎn)入自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣檢測，進(jìn)樣量為2μL。

1.3.3.2 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析:原始數(shù)據(jù)通過Waters Micromass Markerlynx Application Version 4.0完成采集，Markerlynx用來進(jìn)行峰選擇和峰調(diào)整。數(shù)據(jù)經(jīng)Markerlynx導(dǎo)入EXCEL，形成三維數(shù)據(jù)矩陣，在SMICA-P 11.0操作模式下，建立工程，實(shí)現(xiàn)多變量主成分分析(PCA)。

1.3.3.3 生物標(biāo)志物的確定及結(jié)構(gòu)解析:根據(jù)PCA初步確定出可能的生物標(biāo)志物，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜中的分子質(zhì)量檢索Metlin確定出未知代謝物的結(jié)構(gòu)和分子式。查閱相關(guān)數(shù)據(jù)庫，得到相應(yīng)化合物的mol文件。利用Masslynx軟件將文件導(dǎo)入相應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖中，選擇相應(yīng)的正、負(fù)離子模式，進(jìn)行massfragment匹配分析，篩選出最有可能的一種或幾種化合物。

2 結(jié)果

2.1 尿液中游離氨基酸水平 2組受試對(duì)象的尿液中均檢出了15種氨基酸：天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸；另外異亮氨酸和脯氨酸未檢出。另外，2組尿液中蘇氨酸、絲氨酸、纈氨酸和賴氨酸的水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 血液中游離氨基酸水平 2組受試對(duì)象的血清中，17種氨基酸均得到檢出。另外，2組血清中蘇氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和亮氨酸的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組尿液和血液中游離氨基酸含量比較

2.3 尿液中生物標(biāo)志物的篩選和確定 根據(jù)多變量偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis, PLS-DA)篩選AD組病人尿液中的生物標(biāo)志物。在正、負(fù)離子化模式下，參照Scripps、ChemSpider和HMDB數(shù)據(jù)庫，推斷15種化合物可能的結(jié)構(gòu)依次為N-丙烯?；?甘氨酸、精氨基琥珀酸、脫硫生物素、L-乙酰肉堿、異丁酰基-L-肉堿、C16二氫神經(jīng)鞘氨醇、壬二酸、雌二醇-1,3,5,(10),7-4-3,17α-二醇、L-天門冬氨酰-4-磷酸鹽、L-谷氨酰胺、對(duì)甲酚-葡糖苷酸、本膽烷醇酮-葡糖苷酸、5-L-谷?；拾彼?、氨蝶呤、胞嘧啶核苷。上述物質(zhì)在對(duì)照組中均未檢出。

3 討論

3.1 游離氨基酸代謝水平對(duì)AD機(jī)體的影響 氨基酸參與機(jī)體內(nèi)多種活性物質(zhì)的合成和代謝，在機(jī)體的學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)傳導(dǎo)、免疫功能和受體功能等方面發(fā)揮著重要作用[5]。氨基酸的檢測對(duì)于某些疾病的篩查、診斷和治療具有重要意義[6]。氨基酸是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，大腦區(qū)域特定部位的一些氨基酸含量與學(xué)習(xí)記憶能力有關(guān)，對(duì)學(xué)習(xí)記憶和突觸形成至關(guān)重要。天門冬氨酸和谷氨酸等興奮性氨基酸對(duì)神經(jīng)元有興奮作用，大量釋放可損傷神經(jīng)細(xì)胞，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙[7]。本研究AD組尿液中天門冬氨酸和谷氨酸排泄量減少，提示它們?cè)贏D病人體內(nèi)可能發(fā)生了代謝紊亂，過度的轉(zhuǎn)運(yùn)和傳導(dǎo)，可刺激損傷神經(jīng)元，造成記憶損害。蘇氨酸、纈氨酸和賴氨酸是人體必需氨基酸，能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫，改善記憶力，提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能。絲氨酸是人體非必需氨基酸，在體內(nèi)合成，可維護(hù)腦與心臟的功能。這些氨基酸在體內(nèi)共同作用，經(jīng)三羧酸循環(huán)作用于磷酸化合物，能夠促使腦細(xì)胞活性增強(qiáng)，恢復(fù)衰竭的神經(jīng)元，改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能[8]。AD組血液中蛋氨酸的含量明顯低于對(duì)照組。機(jī)體內(nèi)蛋氨酸在蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，與ATP反應(yīng)，可生成Hcy。Hcy可以造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷。研究證實(shí),Hcy是AD發(fā)生發(fā)展過程中一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素[9]。此外，Hcy可以經(jīng)過轉(zhuǎn)硫途徑回轉(zhuǎn)生成半胱氨酸，本研究結(jié)果顯示AD組血清中半胱氨酸顯著高于對(duì)照組，這可能是機(jī)體內(nèi)Hcy的濃度過高，其中一部分通過轉(zhuǎn)硫作用生成了半胱氨酸，導(dǎo)致血清中半胱氨酸的濃度異常升高。

AD病人血清中亮氨酸含量顯著低于對(duì)照組。最新研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的營養(yǎng)感應(yīng)信號(hào)通路與外周組織的代謝分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系密切，其功能紊亂是促發(fā)代謝性疾病的重要原因，亮氨酸缺乏能夠激活下丘腦神經(jīng)元的信號(hào)通路，下丘腦具有神經(jīng)系統(tǒng)的功能，通過營養(yǎng)感應(yīng)信號(hào)通路進(jìn)而激活對(duì)外周組織的代謝調(diào)控。這可能是AD病人機(jī)體內(nèi)氨基酸水平代謝紊亂的一個(gè)重要原因。

3.2 AD病人尿液中代謝物分析 N-丙烯?；?甘氨酸是?；拾彼岬囊环N。研究發(fā)現(xiàn)，在一些先天性代謝紊亂癥病人中，某些特定的酰基甘氨酸排泄量相應(yīng)增多[10]，本研究結(jié)果顯示，AD組中N-丙烯?；?甘氨酸強(qiáng)度高于AD組，而AD組尿液中甘氨酸含量高于對(duì)照組。結(jié)合N-丙烯酰基-甘氨酸的形成過程，分析可得，AD組可能由于機(jī)體內(nèi)代謝途徑發(fā)生紊亂，一方面，導(dǎo)致甘氨酸隨尿液排出體外的量增加，另一方面，導(dǎo)致體內(nèi)甘氨酸和?；o酶A發(fā)生過度的代償反應(yīng)，生成大量的N-丙烯?；?甘氨酸。作為抑制性氨基酸，甘氨酸和其代謝物N-丙烯?；?甘氨酸，在機(jī)體內(nèi)代謝紊亂，致使其保護(hù)神經(jīng)元不被損害的能力下降。

精氨基琥珀酸是鳥氨酸循環(huán)與瓜氨酸-一氧化氮循環(huán)的中間產(chǎn)物，在精氨基琥珀酸合成酶的作用下，由瓜氨酸與天門冬氨酸羧合而成，可進(jìn)一步釋放出延胡索酸而生成精氨酸[11]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生代謝紊亂時(shí)，天門冬氨酸大量蓄積在體內(nèi)，造成精氨基琥珀酸的合成增加，進(jìn)而導(dǎo)致精氨酸在體內(nèi)的增加，作為興奮性氨基酸，天門冬氨酸的過度轉(zhuǎn)運(yùn)和傳導(dǎo)，可損傷神經(jīng)細(xì)胞，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙。

L-乙酰肉堿(LAC)和異丁酰基-L-肉堿(ILC)同屬于醋酸酯類物質(zhì)中的一種。除了在代謝活動(dòng)中發(fā)揮的作用，LAC還具有神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)調(diào)節(jié)和神經(jīng)營養(yǎng)的特性，這些對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)功能使得其在阻止神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展過程中發(fā)揮了十分重要的作用。

L-天門冬氨酰-4-磷酸鹽，在機(jī)體內(nèi)參與賴氨酸和高絲氨酸的生物合成。而賴氨酸具有提高并維護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的作用，因此，認(rèn)為L-天門冬氨酰-4-磷酸鹽與AD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可以作為AD的標(biāo)志物之一。

L-谷氨酰胺是蛋白質(zhì)合成中的編碼氨基酸，屬于人類機(jī)體內(nèi)的一種非必需氨基酸，在體內(nèi)可由葡萄糖轉(zhuǎn)變而來，也可由谷氨酸、纈氨酸及異亮氨酸合成。有研究者認(rèn)為，谷氨酰胺?；h(huán)化酶與AD的發(fā)生關(guān)系密切，有望成為治療AD的新靶點(diǎn)[12]。也有學(xué)者認(rèn)為，血清中谷氨酰胺合成酶在作為診斷AD的生物標(biāo)志物方面并沒有價(jià)值[13]。

5-L-谷?；拾彼崾且环N興奮性氨基酸受體拮抗劑，與γ-氨基丁酸(GABA)的結(jié)構(gòu)相似，GABA是一種抑制性氨基酸，可以減少谷氨酸的釋放，拮抗谷氨酸的毒性，能夠保護(hù)神經(jīng)元處于抑制狀態(tài)，進(jìn)而減少神經(jīng)細(xì)胞的死亡。研究證明，抑制性氨基酸含量的降低，可造成AD病人學(xué)習(xí)記憶障礙[14]。

胞嘧啶核苷是構(gòu)成核酸的嘧啶核苷之一。有研究報(bào)道，膽堿和胞嘧啶核苷是細(xì)胞膜的主要前體物，并且是細(xì)胞膜形成的主要調(diào)控元件，這2種物質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用能夠升高機(jī)體磷脂水平、增加PC12細(xì)胞的表達(dá)和分泌，而β淀粉樣前體蛋白(APP)是細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層的主要跨膜蛋白，所以該研究認(rèn)為這種刺激細(xì)胞膜生物合成的情況也可以用于刺激AD等神經(jīng)退行性疾病中APP的分泌和神經(jīng)突觸的形成[15]。

綜上所述，AD病人體內(nèi)發(fā)生了氨基酸代謝紊亂或障礙，并發(fā)現(xiàn)了AD病人尿液中可能的生物標(biāo)志物，這些結(jié)果對(duì)AD發(fā)病機(jī)制和臨床診療方面的研究提供了一個(gè)新的方向。