武耐英，高 偉 ，楊清山，連運(yùn)河，張紅蕾

（1.河北工程大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院, 河北邯鄲 056038；2.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司, 河北邯鄲 057250）

辣椒除大量用作食用蔬菜外，由于其中活性化合物辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂的存在，使得辣椒在食品、化學(xué)和制藥工業(yè)中應(yīng)用廣泛[1?5]。一般來(lái)說(shuō)，辣椒制品的品質(zhì)與顏色密切相關(guān)，因此有些不法商家應(yīng)用大量的合成染料來(lái)提高產(chǎn)品的審美吸引力。其中，蘇丹紅染料由于其優(yōu)良的感官特征和價(jià)格低廉的特點(diǎn)，經(jīng)常非法用作食品染料[6?7]。據(jù)歐盟快速警報(bào)系統(tǒng)（RASFF）的報(bào)告顯示，許多辣椒制品中均檢出蘇丹紅染料[8]，這樣勢(shì)必會(huì)影響消費(fèi)者的健康。并且國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將蘇丹紅染料列為三類(lèi)致癌物，包括歐洲共同體在內(nèi)的大多數(shù)國(guó)家都不允許將其應(yīng)用于食品中[9]，并逐步確立了蘇丹紅的最大殘留限量和檢測(cè)限量[10?12]。為了有效控制各產(chǎn)品中的蘇丹紅，越來(lái)越多學(xué)者著手于蘇丹紅的檢測(cè)方法及溯源研究[13?15]。

到目前為止，蘇丹紅的污染來(lái)源可歸結(jié)為三類(lèi)：非法添加、交叉污染[16]或天然污染[17?18]。其中，蘇丹紅的天然污染應(yīng)引起人們廣泛關(guān)注。前期研究發(fā)現(xiàn)，辣椒種植過(guò)程中農(nóng)資材料污染不可避免會(huì)引起辣椒蘇丹紅污染，且只有蘇丹紅I污染被檢出[18]，因此在辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂制備過(guò)程中，蘇丹紅I污染會(huì)隨著提取過(guò)程發(fā)生遷移，最終進(jìn)入提取物中。此外，提取、精制過(guò)程要經(jīng)過(guò)干燥和濃縮步驟，污染物可能在這些步驟得以富集，使得提取物中污染物含量水平較高[19?20]。因此，必須了解蘇丹紅I在辣椒活性成分提取過(guò)程中的遷移和分配機(jī)制，以確保辣椒提取行業(yè)的食品安全。有報(bào)道指出，大多數(shù)蘇丹紅在辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂提取過(guò)程中會(huì)遷移至辣椒紅中[21]，但未對(duì)實(shí)驗(yàn)中用到的提取檢測(cè)方法、全過(guò)程蘇丹紅遷移情況進(jìn)行全面研究，遷移機(jī)理也未有涉及。

因此，本研究旨在研究辣椒活性成分提取全過(guò)程中各產(chǎn)品蘇丹紅I含量、蘇丹紅I總量、色價(jià)、總辣椒堿以及遷移率，分析蘇丹紅I遷移規(guī)律及遷移機(jī)理。這些結(jié)果可為去除或降低辣椒活性成分中的蘇丹紅I污染提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)品 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；辣椒堿（97%）、二氫辣椒堿 （90%） 標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司；乙腈、甲酸、乙酸 色譜純，美國(guó)Fisher公司；正己烷、氯化鈉、95%乙醇 分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；1000 kg辣椒 5354號(hào)甜椒 采自新疆庫(kù)爾勒。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS），配以BEH C18柱（50 mm×2.1 mm×5 μm） 美國(guó)Waters公司；Agilent 1260 高效液相色譜 美國(guó)Agilent科技公司；UV-1900 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)日本島津儀器公司；TH-300B超聲波清洗機(jī) 濟(jì)寧天華超聲儀器有限公司；XW-80A漩渦混合器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；FW135研磨機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；H-2050R冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)設(shè)備有限公司；ZH-001制粒機(jī) 河北石家莊新樂(lè)市正宏辣椒機(jī)械有限公司；Milli-Q 超純水器 美國(guó)Millipore公司；0.22 μm針頭過(guò)濾器和0.45 μm針頭過(guò)濾器 上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂的提取 提取辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂的工藝流程如圖1所示，此工藝為優(yōu)化后的工業(yè)生產(chǎn)工藝[22]。實(shí)驗(yàn)時(shí)棄去辣椒籽，保留辣椒皮與胎座，45 ℃烘干，粉碎、過(guò)60目篩。得到的辣椒粉與0.2 MPa的水蒸汽接觸30～40 s的同時(shí)造粒成圓筒狀的辣椒粒。用正己烷（m:v=1:2.5）在55 ℃萃取辣椒粒150 min后，蒸發(fā)正己烷，獲得紅辣素（由辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂構(gòu)成）。隨后，在45 ℃加入5%的氯化鈉溶液進(jìn)行沉淀（m:v=2:1）。待固液分離完全后，棄去沉淀，上清液紅辣素層用95%乙醇提純兩次。最后，上層液在真空度0.09 MPa、90 ℃下精制1～2 h，得到辣椒油樹(shù)脂。下層液在真空度0.09 MPa、50 ℃下精制5～6 h，得到辣椒紅。

圖1 活性成分辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂提取工藝流程Fig.1 Scheme for active ingredients paprika red and capsicum oleoresin extraction process

1.2.2 蘇丹紅I的提取和測(cè)定 采集三批辣椒原料，每批樣品從不同包裝中隨機(jī)抽取三份樣本。按照歐盟修訂方法提取蘇丹紅I[23]。準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥后的辣椒原料，及提取過(guò)程中獲得的辣椒粉、辣椒粒、紅辣素、辣椒紅、辣椒油樹(shù)脂（固體樣品需粉碎混勻，液體樣品需混合均勻），按m:v=1:10加入乙腈，用漩渦混合器充分混合，超聲500 W提取10 min，10000 r/min，5 ℃下離心5 min，取上清液，用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后進(jìn)行檢測(cè)。

蘇丹紅I測(cè)定：采用UPLC-MS/MS檢測(cè)，色譜柱為反相C18Waters ACQUITY BEH 柱（50 mm×2.1 mm，5 μm）；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣體積為10 μL；流動(dòng)相由乙腈（溶劑A）和0.1%甲酸水溶液（溶劑B）組成，流速為0.35 mL/min，流動(dòng)相梯度洗脫條件為：0～0.5 min為70% A，0.5～3 min線(xiàn)性增至95% A，保持1 min，1 min內(nèi)降至70% A。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子檢測(cè)（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）對(duì)定性和定量離子進(jìn)行MS測(cè)定。毛細(xì)管電壓，1.0 kV； 萃取錐孔電壓，3.0 V；RF透鏡電壓，0.0 V；錐孔反吹氣流量，50 L/h； 脫溶劑氣流量，700 L/h。采用249.3/93.1和249.0/156.1離子對(duì)定性，249.3/156.1離子對(duì)定量。離子源溫度和脫溶溫度分別為120 ℃和420 ℃。

用空白樣品處理液配成系列蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以峰面積對(duì)被測(cè)組分的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以3倍和10倍信噪比（S/N）確定方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）?？瞻讟悠分刑砑尤齻€(gè)不同水平的蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.4、 4.0、 10.0 μg/kg），測(cè)定回收率，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。辣椒的不同部分，胎座、果皮、籽中蘇丹紅I的提取和測(cè)定。

1.2.3 色價(jià)和總辣椒堿含量的測(cè)定 辣椒紅中的色素含量可用色價(jià)值衡量。辣椒油樹(shù)脂中的辛辣成分含量可用總辣椒堿衡量，主要包含辣椒堿、二氫辣椒堿和降二氫辣椒堿。為明確活性物質(zhì)提取方法的可靠性、蘇丹紅I在提取過(guò)程中的遷移規(guī)律以及與色價(jià)及總辣椒堿遷移規(guī)律，對(duì)各產(chǎn)品的色價(jià)和總辣椒堿均進(jìn)行測(cè)定。

采用GB 1886.34-2015 的方法測(cè)定辣椒、辣椒粉、辣椒粒、紅辣素、辣椒油樹(shù)脂、辣椒紅色素的色價(jià)[24]。根據(jù)不同樣品色價(jià)值調(diào)整稀釋倍數(shù)，確保吸光度值在0.3～0.7之間。色價(jià)的計(jì)算公式如下：

辣椒、辣椒粉、辣椒粒、紅辣素、辣椒油樹(shù)脂、辣椒紅色素中的總辣椒堿含量的提取和測(cè)定方法可概括如下[25]： 將25 g辣椒、辣椒粉、辣椒粒分別用95%乙醇回流，2 g紅辣素、200 g辣椒紅、0.1 g辣椒油樹(shù)脂分別在80 ℃下用95%乙醇超聲輔助提取2 h。用0.45 μm濾膜過(guò)濾提取液，反相高效液相色譜-紫外檢測(cè)器測(cè)定。流動(dòng)相由0.6%乙酸（溶劑A），59.4%水（溶劑B）和40%乙腈（溶劑C）組成，等度洗脫。流動(dòng)相流速為1.5 mL/min，波長(zhǎng)設(shè)置為280 nm。

以辣椒堿和二氫辣椒堿作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立測(cè)定總辣椒堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度X（mg/L）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸，得到辣椒堿和二氫辣椒堿的回歸方程分別為：Y=5.84×103?1.62×103X，r2=0.9993；Y=6.13×103?5.07×103X，r2=0.9996。線(xiàn)性范圍均為20～100 mg/L。以三倍信噪比計(jì)算辣椒堿和二氫辣椒堿檢出限分別為0.5 mg/L和0.1 mg/L。因二氫辣椒堿和降二氫辣椒堿結(jié)構(gòu)非常相似（圖2），降二氫辣椒堿定量時(shí)采用二氫辣椒堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，考慮到兩者分子量的不同，將降二氫辣椒堿出峰處峰面積對(duì)應(yīng)的濃度換算為降二氫辣椒堿濃度。以辣椒堿、二氫辣椒堿和降二氫辣椒堿之和計(jì)算總辣椒堿含量。

圖2 辣椒堿、二氫辣椒堿和降二氫辣椒堿的分子結(jié)構(gòu)Fig.2 Molecular structure of capsanthin, dihydrocapsaicin and nordihydrocapsaicin

1.2.4 遷移率計(jì)算 假設(shè)提取了1000 kg的辣椒原料，基于每個(gè)樣本的質(zhì)量和蘇丹紅I的含量計(jì)算得到蘇丹紅I總量（μg）。

辣椒、辣椒粉、辣椒粒、紅辣素、辣椒油樹(shù)脂、辣椒紅色素的色價(jià)、總辣椒堿和蘇丹紅I的遷移率使用公式（2）計(jì)算：

其中，X提取物表示萃取后樣品的色價(jià)、總辣椒堿和蘇丹紅總量。X原料分別表示原料辣椒的色價(jià)、總辣椒堿和蘇丹紅I總量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

工藝流程圖采用Microsoft Visio 2007繪制。采集三批辣椒樣品，每批從不同包裝中隨機(jī)抽取三份辣椒樣本。每份辣椒樣本及提取得到的辣椒粉、辣椒粒、紅辣素、辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂的色價(jià)、總辣椒堿、蘇丹紅I含量均平行測(cè)定三次，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。蘇丹紅I遷移率用九個(gè)樣本的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)采用SPSS version 21軟件處理，應(yīng)用Duncan’s法進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05為顯著性差異，同一列不同字母表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的驗(yàn)證

從辣椒中提取的色素和辛辣物質(zhì)分別是辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂。提取過(guò)程中每個(gè)產(chǎn)品的色價(jià)和總辣椒堿遷移率結(jié)果見(jiàn)表1。由結(jié)果可見(jiàn)，辣椒紅的總辣椒堿遷移率和辣椒油樹(shù)脂的色價(jià)遷移率與其它物質(zhì)存在顯著性差異（P＜0.05）。辣椒紅含有較多的色素類(lèi)物質(zhì)，色價(jià)遷移率為96.32%，而辣椒油樹(shù)脂含有較多的辣味類(lèi)物質(zhì)，它的總辣椒堿遷移率為97.43%。辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂的總色價(jià)遷移率為97.01%，總辣椒堿遷移率為97.57%，表明辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂提取過(guò)程能較大程度保留辣椒原料中的色價(jià)和總辣椒堿，該提取方法是可行的。

表1 辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂提取過(guò)程中色價(jià)和總辣椒堿的遷移率(%)Table 1 Transfer rate of color value and total capsaicinoids during the extraction process of paprika red and capsicum oleoresin(%)

2.2 提取過(guò)程各產(chǎn)品中蘇丹紅I的含量

本研究的辣椒原料中僅檢測(cè)出蘇丹紅I，未檢到蘇丹紅II、III和IV存在，該結(jié)果與前期研究結(jié)果吻合[17?18]。對(duì)辣椒、辣椒粉、辣椒粒、紅辣素、辣椒紅和辣椒油樹(shù)脂中蘇丹紅I的檢測(cè)方法性能進(jìn)行了研究，結(jié)果如表2。線(xiàn)性范圍為0.1～20 μg/kg，檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）分別為0.04～0.09 μg/kg和0.09～0.25 μg/kg，回收率在84.13%～90.25%之間。同時(shí)，對(duì)6個(gè)相同加標(biāo)樣品分別進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)方法的精密度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.25%～8.76%。結(jié)果表明，該方法可以滿(mǎn)足蘇丹紅I檢測(cè)。

表2 蘇丹紅I檢測(cè)方法性能研究Table 2 Major analytical performance for the determination of Sudan I

辣椒中蘇丹紅I的含量為0.08～0.22 μg/kg（表3），遠(yuǎn)低于歐洲委員會(huì)設(shè)定的13 mg/kg[10]。辣椒粉中蘇丹紅I質(zhì)量濃度比辣椒中增加了4.5%～12.5%。隨后采用造粒的方式來(lái)提高過(guò)濾和提取效率，由于造粒過(guò)程只有形狀發(fā)生了改變，因此辣椒粒中蘇丹紅I含量與辣椒粉中持平。正己烷萃取后紅辣素的質(zhì)量約為辣椒粒的1/10，相應(yīng)地紅辣素中的蘇丹紅I含量約為辣椒粒的9.4～10.7倍，表明辣椒粒中的蘇丹紅I幾乎全部得以萃取至紅辣素中。最終，辣椒紅中含有0.98～2.94 μg/kg蘇丹紅I，而辣椒油樹(shù)脂中未檢測(cè)到蘇丹紅I。從結(jié)果可以看出，經(jīng)過(guò)工業(yè)提取，蘇丹紅I幾乎全部留在辣椒紅中。

表3 不同批次提取中各產(chǎn)品質(zhì)量遷移率及蘇丹紅I的含量Table 3 Mass transfer rate and concentration of Sudan I in different products of different batches

同時(shí)，對(duì)辣椒各部分，即辣椒胎座、辣椒皮和籽的干重及其中的蘇丹紅I分布進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表4。由結(jié)果可見(jiàn)，辣椒中的蘇丹紅I主要存在于辣椒皮中，其殘留量占全辣椒的86%，辣椒籽中蘇丹紅I殘留量最少。研究中只選取了辣椒皮和胎座用于粉碎，且辣椒籽中蘇丹紅I含量較低，所以棄去辣椒籽后，辣椒粉中蘇丹紅I質(zhì)量濃度比辣椒中有所增加。

2.3 蘇丹紅I遷移規(guī)律

依據(jù)提取時(shí)每批樣品不同樣本的質(zhì)量和檢出的蘇丹紅I水平，計(jì)算出各個(gè)產(chǎn)品中蘇丹紅I的總量（μg），用以計(jì)算蘇丹紅I在每個(gè)過(guò)程中的遷移率（表5）。

表5 不同產(chǎn)品蘇丹紅I總含量（μg）和蘇丹紅I遷移率（%）Table 5 Total Sudan I amount (μg) and transfer rate of Sudan I (%) at different products

在目前的研究中，辣椒籽質(zhì)量占全辣椒質(zhì)量的12.10%，籽中蘇丹紅I總量占全辣椒的4.75%（表4）。工業(yè)生產(chǎn)中粉碎過(guò)程采用投包割料方式，該過(guò)程質(zhì)量會(huì)損失35.20%（表4），這樣就意味著辣椒皮和胎座存在23.30%的質(zhì)量損失，因此辣椒粉中保留了辣椒中蘇丹紅I總量的70.0%。造粒和隨后的提取過(guò)程對(duì)蘇丹紅I遷移的影響可以忽略不計(jì)（P＞0.05）。幾乎所有存在于紅辣素中的蘇丹紅I都轉(zhuǎn)移到辣椒紅中，約為辣椒中的67.56%，而辣椒油樹(shù)脂中未檢測(cè)到蘇丹紅I。

表4 辣椒胎座、辣椒皮及籽的干重、蘇丹紅I含量及蘇丹紅I總量Table 4 Dry weight, concentration of Sudan I and the total Sudan I amount of paprika pericarp, placenta and seeds

從整個(gè)提取過(guò)程來(lái)看，蘇丹紅I僅在95%乙醇加入后的分離過(guò)程進(jìn)行了重新分配，在整個(gè)提取過(guò)程中均未有減少。用95%乙醇分離紅辣素后，溶液進(jìn)入兩相體系，由上層醇溶相和下層油溶相組成，蘇丹紅I將在兩相之間分配。包含辣椒堿，二氫辣椒堿和降二氫辣椒堿的辣椒堿類(lèi)化合物由于極性與乙醇相似而易于轉(zhuǎn)移至上層醇溶相中[26]。相反，辣椒紅中的色素主要包括辣椒玉紅素和辣椒紅素[27]。辣椒中70%～80%的辣椒紅色素是以脂肪酸酯形式存在，酯化過(guò)程使得辣椒紅色素的脂溶性更強(qiáng)[28?29]，因此辣椒紅傾向于轉(zhuǎn)移至下層油溶相。文獻(xiàn)表明，化合物的親和力取決于其物理化學(xué)性質(zhì)，如分子量、親脂性（log P）。蘇丹紅I的log P為5.86，高于3，所以為高度親脂性化合物[30]，因此高親脂性的蘇丹紅I傾向于進(jìn)入下層油溶層的辣椒紅中。

3 結(jié)論

在辣椒油樹(shù)脂和辣椒紅的提取過(guò)程中，蘇丹紅I只在辣椒去籽操作環(huán)節(jié)去除一部分，其余蘇丹紅I全部遷移至辣椒紅中。辣椒紅中蘇丹紅I約占全辣椒蘇丹紅I總量的67.56%。蘇丹紅I遷移性主要是由于與辣椒紅相似的脂溶性決定的。本研究中辣椒加工過(guò)程中蘇丹紅I的污染情況、遷移、分配機(jī)理的系統(tǒng)性研究，可以為適時(shí)調(diào)整提取工藝提供可行的建議。