肖 俐， 羅 秋 穎， 劉 春 曉， 陶 虹 宇， 李 憲 臻， 俞 志 敏

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

黃原膠(Xanthan)是一種由黃單胞菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的胞外多糖[1]，具有很高黏度和分子質(zhì)量的天然多糖，黃原膠易溶于水，抗水解能力優(yōu)于很多其他水溶性多糖或者多聚體[2]。黃原膠對(duì)酸堿也有較好的耐受能力，在pH 1～13，黃原膠的黏性不受影響[3]。黃原膠還被廣泛用作食品添加劑[4]，不僅能夠提高微生物的穩(wěn)定性，也可以作為農(nóng)用化學(xué)品或植物保護(hù)劑的載體，以促進(jìn)它們的黏附并保留在植物葉子中，甚至黃原膠及其衍生物作為植物啟動(dòng)子、誘導(dǎo)子或刺激物參與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)[5]。

以往的研究發(fā)現(xiàn)黃原膠具有一定的生理活性[5]，但是對(duì)于黃原膠促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在大麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)階段通過(guò)不同方式添加不同濃度的黃原膠溶液，研究其對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，以期篩選最佳施用方式和最佳施用濃度。

1 材料與方法

1.1 材 料

大麥(HordeumvulgareL.)，中糧麥芽(大連)有限公司；黃原膠，山東阜豐發(fā)酵有限公司；霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液，上海鈺博生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 種子處理

選取顆粒飽滿的大麥種子15份，每份100粒，置于燒杯中，加入50 mL 3%的次氯酸鈉浸泡種子10 min，用50 mL去離子水清洗3遍。將大麥分別浸入50 mL去離子水(CK)、1 mg/L(A)、10 mg/L(B)、100 mg/L(C)、200 mg/L(D)的黃原膠溶液中，環(huán)境溫度保持20 ℃，浸泡24 h。每個(gè)處理100粒，3組平行。之后用去離子水沖洗去除種子表面黃原膠溶液，沖洗干凈的種子置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，加入10 mL去離子水。大麥種子于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中避光發(fā)芽3 d，發(fā)芽溫度22 ℃，濕度95%，在發(fā)芽過(guò)程中保持大麥種子表面濕潤(rùn)，使大麥發(fā)芽充分。第3天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。

1.2.2 幼苗處理

將發(fā)芽結(jié)束的幼苗從培養(yǎng)箱中移出，采用霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行水培，待大麥幼苗長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)對(duì)葉片進(jìn)行表面噴施處理，并在營(yíng)養(yǎng)液中添加體積分?jǐn)?shù)10%的黃原膠溶液。實(shí)驗(yàn)共設(shè)15個(gè)處理組，分別為CK1(僅去離子水浸種)、CK2(去離子水浸種，噴施1 mg/L黃原膠)、CK3(去離子水浸種，營(yíng)養(yǎng)液添加10% 1 mg/L黃原膠)；A1(1 mg/L 黃原膠浸種)、A2(1 mg/L黃原膠浸種，噴施1 mg/L黃原膠)、A3(1 mg/L黃原膠浸種，營(yíng)養(yǎng)液添加10% 1 mg/L黃原膠)；B1(10 mg/L黃原膠浸種)、B2(10 mg/L黃原膠浸種，噴施10 mg/L 黃原膠)、B3(10 mg/L黃原膠浸種，營(yíng)養(yǎng)液添加10% 10 mg/L黃原膠)；C1(100 mg/L黃原膠浸種)、C2(100 mg/L黃原膠浸種，噴施100 mg/L 黃原膠)、C3(100 mg/L黃原膠浸種，營(yíng)養(yǎng)液添加10%、100 mg/L黃原膠)；D1(200 mg/L黃原膠浸種)、D2(200 mg/L黃原膠浸種，噴施200 mg/L黃原膠)、D3(200 mg/L黃原膠浸種，營(yíng)養(yǎng)液添加10% 200 mg/L黃原膠)。每個(gè)處理設(shè)2組平行實(shí)驗(yàn)，每組50株幼苗。

1.2.3 發(fā)芽相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

發(fā)芽勢(shì)(Gp)=n/N×100%

式中：n為規(guī)定天數(shù)內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)，N為種子總數(shù)。

發(fā)芽率(Gv)=no/No×100%

式中：no為結(jié)束發(fā)芽時(shí)發(fā)芽種子數(shù)，No為種子總數(shù)。

發(fā)芽指數(shù)(Gi)=∑Gt/t

式中：Gt為第t天的發(fā)芽數(shù)，t為時(shí)間，d。

活力指數(shù)(Vi)=GiS

式中：S為最后1 d的幼苗生長(zhǎng)勢(shì)(根干重)。

1.2.4 幼苗相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

大麥幼苗處理21 d后，測(cè)定各處理組大麥幼苗生理指標(biāo)(株高、根長(zhǎng)、濕重)、葉綠素含量、抗氧化酶活性(POD、CAT、SOD)、膜脂抗氧化程度(丙二醛(MDA)含量)、幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性[6]。

1.2.4.1 生理指標(biāo)

測(cè)量大麥幼苗株高和根長(zhǎng)，稱重。

1.2.4.2 葉綠素含量的測(cè)定

取大麥葉片0.5 g于研缽中，加入少量石英石及碳酸鈣粉，加入80%丙酮2～3 mL，研磨成勻漿，用80%丙酮沖洗研缽并轉(zhuǎn)移至25 mL棕色容量瓶，定容。搖勻后，3 000 r/min離心10 min，取上清液在波長(zhǎng)663、645、652和440 nm下測(cè)定吸光度(以80%丙酮為空白)。計(jì)算葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量[7]。

ca=12.21A663-2.81A645

cb=20.13A645-5.03A663

1.2.4.3 抗氧化酶活性

POD活性的測(cè)定[8]：取大麥葉片0.5 g于研缽中，加入20 mmol/L的KH2PO4溶液25 mL研磨，10 000 r/min離心10 min，上清液冷藏，殘?jiān)?5 mL KH2PO4再提取一次，合并上清液。取兩只比色皿，一只加入反應(yīng)液3 mL和KH2PO41 mL為對(duì)照，另一只加入反應(yīng)混合液3 mL 和酶液1 mL(活性過(guò)高可稀釋)。470 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，每30 s讀數(shù)一次。以每分鐘吸光度的變化值表示酶活性。

CAT活性的測(cè)定[8]：取大麥葉片1.0 g于預(yù)冷的研缽中，加入50 mol/L pH 7.8磷酸緩沖液(PBS)8 mL，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，上清液即為酶液。PBS(0.15 mmol/L pH 7.0)取200 mL加入0.309 2 mL 30% H2O2溶液混合均勻?yàn)榉磻?yīng)液。取3 mL反應(yīng)液加0.1 mL酶液，以PBS為對(duì)照，240 nm波長(zhǎng)下測(cè)定40 s內(nèi)OD值的變化。以每分鐘OD降低0.01為一個(gè)酶活性單位。

SOD活性的測(cè)定[8]：取大麥葉片2.5 g于研缽中，加入pH 7.8磷酸緩沖溶液冰浴研磨成勻漿，定容至25 mL，12 000 r/min冷凍離心20 min。取質(zhì)地相同的比色管，兩只對(duì)照，一只避光保存，與其他各比色管同時(shí)置于4 000 lx光照下反應(yīng)30 min，反應(yīng)溫度25～35 ℃，以避光的比色管為空白對(duì)照，在560 nm下比色，計(jì)算SOD活性。

式中：A0為對(duì)照管吸光度；As為樣品管吸光度；Vt為樣品液總體積，mL；V1為測(cè)定時(shí)樣品用量，mL；mf為樣品鮮重，g。

1.2.5 膜脂抗氧化程度

取大麥葉片1.0 g于研缽中，加入10%三氯乙酸(TCA)2 mL和少量石英石，研磨勻漿，再加入8 mL TCA進(jìn)一步研磨，轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃下4 000 r/min離心10 min，吸取上清液2 mL(對(duì)照加2 mL去離子水)加入2 mL 0.67%硫代巴比妥酸(TBA)，充分混勻后沸水浴15 min。迅速冷卻離心，取上清液測(cè)532、600、450 nm下吸光度。

MDA質(zhì)量摩爾濃度=6.45(A532-A600)-0.56A450

1.2.6 幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性

幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定[9-10]：稱取大麥葉片1.0 g于預(yù)冷的研缽中，加0.1 mol/L的乙酸緩沖液(pH 5.0)5 mL冰浴研磨，12 000 r/min離心10 min，上清液在12 000 r/min下再離心10 min，上清液置于冰箱保存。取酶液0.4 mL，加入40 mL 1%蝸牛酶，37 ℃水浴反應(yīng)30 min后加入0.2 mL飽和硼砂，放在沸水浴中7 min，冷卻后加入2 mL冰醋酸和1 mL 1%對(duì)二甲氨基苯甲醛(DMAB)，37 ℃保溫15 min，585 nm下測(cè)定吸光度。酶活性單位(U)定義：每克植物材料產(chǎn)生1 mmol N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量。

β-1，3-葡聚糖酶活性的測(cè)定[11]：稱取大麥葉片0.5 g于預(yù)冷的研缽中，加0.05 mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)3 mL和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)0.0 5 g，在冰浴中充分研磨，4 ℃下12 000 r/min 離心15 min，上清液在12 000 r/min下再離心10 min，所得上清液即為粗酶液，放于冰箱保存。取1 mg/mL的昆布多糖(溶于醋酸鈉緩沖液)0.4 mL，加入0.1 mL酶液，于37 ℃保溫15 min，立即加入0.5 mL銅試劑混勻，并于100 ℃ 水浴10 min，置冷水中冷卻，再加入砷鉬酸試劑0.5 mL，呈現(xiàn)藍(lán)色后加去離子水3.5 mL，搖勻，660 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品液的還原糖含量。一個(gè)酶活性單位(U)定義：每克植物材料產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃原膠施用質(zhì)量濃度對(duì)大麥種子發(fā)芽的影響

從表1中可以看出，施用黃原膠浸種能夠顯著影響大麥種子發(fā)芽，A、B兩個(gè)處理組發(fā)芽率均顯著提升，其中處理A(1 mg/L黃原膠浸種)與CK(去離子水浸種)相比發(fā)芽率提升了10%，處理B(10 mg/L黃原膠)與CK相比發(fā)芽率提升了4%，處理C(100 mg/L黃原膠)和處理D(200 mg/L 黃原膠)發(fā)芽率有所下降，這可能是黃原膠濃度過(guò)高引起的。低濃度的黃原膠溶液能夠顯著地促進(jìn)大麥種子發(fā)芽率的提高。從發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)來(lái)看，處理A和B顯著優(yōu)于CK，說(shuō)明低濃度的黃原膠溶液能夠顯著促進(jìn)大麥種子發(fā)芽，最適質(zhì)量濃度為1 mg/L，高質(zhì)量濃度的黃原膠則有一定的抑制作用。

表1 黃原膠施用濃度對(duì)大麥種子發(fā)芽的影響

2.2 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對(duì)大麥幼苗生長(zhǎng)的影響

從表2中可以看出，黃原膠能夠顯著影響大麥幼苗的生長(zhǎng)。從平均濕重看，處理B顯著優(yōu)于其他各處理組，處理A和處理C相比于CK也有明顯提高。從株高看，處理B和處理C的株高顯著高于對(duì)照。從根長(zhǎng)看，各處理組根長(zhǎng)基本持平且略低于對(duì)照組。同時(shí)可以看到，在葉面噴施黃原膠對(duì)株高的影響更為顯著，在營(yíng)養(yǎng)液中添加黃原膠對(duì)根長(zhǎng)有較大的影響，而且僅浸種處理的大麥幼苗相對(duì)于其他兩種方式處理的大麥幼苗并沒(méi)有特別明顯的差距，說(shuō)明僅僅在浸種階段添加黃原膠已經(jīng)能夠有效的促進(jìn)大麥種子的發(fā)芽。

表2 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對(duì)大麥幼苗生長(zhǎng)的影響

2.3 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對(duì)大麥幼苗葉綠素含量的影響

從圖1中可以看出，經(jīng)過(guò)黃原膠處理的大麥幼苗嫩葉中葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量與對(duì)照相比變化并不顯著，而通過(guò)葉面噴施黃原膠能夠有效提高葉綠素質(zhì)量濃度。當(dāng)黃原膠質(zhì)量濃度為1 mg/L時(shí)，在葉面噴施黃原膠溶液相比于僅浸種處理的大麥幼苗，葉綠素質(zhì)量濃度提升了18%。另外，黃原膠對(duì)葉綠素a的影響更大，而對(duì)葉綠素b影響相對(duì)較小。

圖1 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對(duì)大麥幼苗葉綠素質(zhì)量濃度的影響

2.4 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對(duì)大麥幼苗抗氧化酶活性的影響

2.4.1 對(duì)POD活性的影響

從圖2可以看出，黃原膠能夠顯著提升大麥幼苗中POD活性，提升的幅度隨黃原膠質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)黃原膠質(zhì)量濃度為1 mg/L 時(shí)相比于空白POD活性增加了20%。在葉片表面施用黃原膠溶液更能有效提升POD酶活性，當(dāng)黃原膠質(zhì)量濃度為1和10 mg/L時(shí)，相對(duì)于空白POD酶活性分別提升了19.5%和20.7%。在營(yíng)養(yǎng)液中添加黃原膠對(duì)POD酶活性并沒(méi)有顯著影響。

圖2 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對(duì)大麥幼苗POD活性的影響

2.4.2 CAT活性的影響

從圖3可以看出，低濃度的黃原膠溶液能夠有效提升CAT酶的活性，高濃度黃原膠對(duì)CAT酶活性稍有抑制。黃原膠質(zhì)量濃度為1和10 mg/L 時(shí)影響最為顯著，分別提升了34.7%和41.5%。葉面噴施的效果優(yōu)于在營(yíng)養(yǎng)液中添加黃原膠。其中10 mg/L的黃原膠溶液在葉面噴施時(shí)CAT酶活力最高，為0.993 U/(g·min)；10 mg/L 的黃原膠溶液在營(yíng)養(yǎng)液中添加的CAT酶活力為0.940 U/(g·min)。

圖3 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對(duì)大麥幼苗CAT活性的影響

2.4.3 對(duì)SOD活性的影響

從圖4可以看出，用黃原膠處理大麥幼苗能夠提升SOD的酶活力，低濃度黃原膠效果更好，1、10、100和200 mg/L分別提升了15.6%、22.2%、13.2%和5.0%。在大麥幼苗葉片表面噴施黃原膠效果最好，黃原膠質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)SOD酶活力最高，為215.32 U/(g·h)。結(jié)果表明，低濃度的黃原膠能夠提升SOD酶活力，隨著黃原膠濃度的升高而逐漸失去作用。

圖4 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對(duì)大麥幼苗SOD的影響

2.5 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對(duì)膜脂抗氧化程度的影響

由圖5可以看出，低濃度的黃原膠能夠有效降低大麥葉片的膜脂氧化程度，與對(duì)照相比1 mg/L 的黃原膠MDA質(zhì)量摩爾濃度降低了8%，10 mg/L的黃原膠MDA質(zhì)量摩爾濃度降低了28%。而高濃度的黃原膠溶液反而加劇了膜脂過(guò)氧化程度。就施加方式而言，在葉面噴施黃原膠溶液比在營(yíng)養(yǎng)液中添加黃原膠溶液更能夠避免膜脂的過(guò)氧化程度，質(zhì)量濃度為10 mg/L的黃原膠浸種且葉面噴施黃原膠的大麥幼苗MDA質(zhì)量摩爾濃度最低，為3.28 mmol/g。

圖5 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對(duì)大麥幼苗葉膜脂抗氧化程度的影響

2.6 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對(duì)幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活力的影響

2.6.1 對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響

從圖6可以看出來(lái)，僅用黃原膠浸種對(duì)大麥幼苗葉片的幾丁質(zhì)酶活力影響不大，但是通過(guò)在葉面表面施用黃原膠溶液能有效提高幾丁質(zhì)酶活力，而在營(yíng)養(yǎng)液中添加黃原膠溶液，在濃度低的情況下也能提升幾丁質(zhì)酶活力，高濃度的黃原膠則影響不大。其中葉片表面噴灑1 mg/L黃原膠時(shí)幾丁質(zhì)酶活力最大，為6.81 U/g，其次是在營(yíng)養(yǎng)液中添加1 mg/L黃原膠，幾丁質(zhì)酶活力為6.30 U/g。

圖6 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對(duì)大麥幼苗幾丁質(zhì)酶活力的影響

2.6.2 對(duì)β-1，3-葡聚糖酶活力的影響

從圖7中可以看出，無(wú)論是哪種施加方式，黃原膠都能夠提升大麥幼苗葉片中β-1，3-葡聚糖酶的活性。而在營(yíng)養(yǎng)液中添加黃原膠，低濃度有促進(jìn)作用，2個(gè)高濃度處理反而降低了大麥幼苗葉片中β-1，3-葡聚糖酶活力。

圖7 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對(duì)大麥幼苗β-1，3-葡聚糖酶活力的影響

3 結(jié) 論

黃原膠能夠?qū)Υ篼湻N子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用，提升大麥幼苗品質(zhì)。結(jié)果表明，黃原膠能夠促進(jìn)大麥種子萌發(fā)，黃原膠溶液質(zhì)量濃度為1 mg/L對(duì)大麥種子發(fā)芽的促進(jìn)效果最為顯著。低濃度的黃原膠通過(guò)葉面噴施的方式處理大麥幼苗可有效提升大麥幼苗品質(zhì)。當(dāng)葉面噴施質(zhì)量濃度為1 mg/L的黃原膠溶液時(shí)，葉綠素質(zhì)量濃度提升了18%，POD活性提高了20%，同時(shí)幼苗的膜脂氧化程度也降低；當(dāng)噴施的黃原膠質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)，CAT活性和SOD活性分別提升了41.5%和22.2%。黃原膠還能提升幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活力，從而提升大麥幼苗的抗病能力。