朱 靖 博， 王 琳， 丁 燕， 王 振 中， 蕭 偉

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司， 江蘇 連云港 222001 )

0 引 言

熱毒寧注射液由梔子、青蒿和金銀花等3種中藥組成，具有清熱解毒的功效，在臨床中多應(yīng)用于風(fēng)寒、咳嗽、發(fā)燒和上呼吸道感染等治療[1-2]。熱毒寧注射液化學(xué)成分復(fù)雜，主要包括環(huán)烯醚萜類化學(xué)物質(zhì)和有機(jī)酸類化學(xué)物質(zhì)[3-4]。梔子苷具有抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、降血糖、抗腫瘤等藥效作用[5-6]；綠原酸具有保護(hù)心血管、降糖、降脂、抗病毒、抗癌等藥理作用[7-8]。斷氧化馬錢子苷也為熱毒寧注射液重點(diǎn)研究化合物，并且多次出現(xiàn)于熱毒寧注射液成分測(cè)定中[9-10]。3種化合物為熱毒寧注射液中的主要成分，含量用于熱毒寧注射液質(zhì)量評(píng)價(jià)[11-12]。采用傳統(tǒng)的分離純化方法制備3種主要成分[13-14]，存在需要反復(fù)上樣等制約制備效率的問題；而制備型二維色譜法具有分離能力強(qiáng)、設(shè)備簡(jiǎn)單和上樣量大等特點(diǎn)，對(duì)于分離純化復(fù)雜中藥中的化合物具有制備效率高的優(yōu)勢(shì)[15-17]。

本研究利用制備型離線二維色譜對(duì)熱毒寧注射液進(jìn)行分離，并對(duì)其中主要成分梔子苷、綠原酸和斷氧化馬錢子苷進(jìn)行制備，并對(duì)該方法的峰容量和正交度進(jìn)行測(cè)定，以期作為分離制備復(fù)雜中藥化合物的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熱毒寧注射液，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司；梔子苷、綠原酸和斷氧化馬錢子苷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，實(shí)驗(yàn)室自制，純度大于98%，且由質(zhì)譜鑒定結(jié)構(gòu)。色譜級(jí)甲醇、乙腈及工業(yè)級(jí)甲醇，天津大茂化學(xué)試劑廠。

Ultimate 3000高效液相色譜儀，配有Ultimate 3000泵、Ultimate 3000自動(dòng)進(jìn)樣器、Ultimate 3000 PDA檢測(cè)器；C18分析柱、Xion分析柱(4.6 mm×250 mm，10 μm)，大連博邁科技發(fā)展有限公司；動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)制備柱C18(250 mm×1 000 mm，10 μm)、制備型液相色譜柱C18(50 mm×250 mm，10 μm)、制備型色譜柱，大連博邁科技發(fā)展有限公司。制備色譜檢測(cè)器為UV-230型紫外檢測(cè)器，大連依利特分析儀器有限公司。

1.2 樣品前處理

首先稱取0.1 g熱毒寧注射液樣品，加入體積比4∶6的甲醇-水溶液，配制成20 mg/mL溶液，經(jīng)過0.45 μm微孔膜過濾，作為分析樣品。另取熱毒寧注射液樣品80 g，加入5%乙腈水溶液，配制成200 mg/mL溶液，經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾，用于一維制備柱分離制備。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照?qǐng)D譜的建立

精密稱取梔子苷、綠原酸以及斷氧化馬錢子苷標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg混合，加入體積比4∶6甲醇-水溶液，配制成20 mg/mL溶液，使用液相色譜測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)品，如圖1所示。色譜條件：C18色譜柱，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，洗脫條件見表1條件1，體積流量為1.0 mL/min。

圖1 梔子苷、綠原酸和斷氧化馬錢子苷混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖

表1 液相色譜梯度條件

1.4 二維色譜分離條件優(yōu)化

使用高效液相色譜對(duì)熱毒寧注射液二維分離條件進(jìn)行優(yōu)化，以峰容量為參考指標(biāo)。選用C18色譜柱和Xion色譜柱(4.6 mm×250 mm，10 μm)搭配不同的流動(dòng)相分析熱毒寧注射液樣品，并根據(jù)色譜圖比較各自峰容量以及組合的理論正交度，色譜條件：

C18色譜柱，流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫條件見表1條件1，體積流量0.8 mL/min。

Xion色譜柱，流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫見表1梯度條件2，體積流量為0.8 mL/min。

C18色譜柱，乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫條件見表1條件3，體積流量為0.8 mL/min。

1.5 制備型二維液相色譜分離熱毒寧注射液

1.5.1 第一維動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)制備色譜分離

將選擇的分析型液相色譜條件線性放大至二維制備柱中，并按照線性放大公式(1)考察上樣量。

(1)

式中：mp為制備柱上樣量，g；ma為分析柱上樣量，g；lp為制備柱長(zhǎng)度，mm；la為分析柱長(zhǎng)度，mm；dp為制備柱內(nèi)徑，mm；da為分析柱內(nèi)徑，mm。

動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)色譜參數(shù)：C18色譜柱(250 mm×1 000 mm，10 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，體積流量500 mL/min，洗脫梯度見表1條件3。

按照公式(1)，質(zhì)量由20 mg放大至80 g。熱毒寧注射液一次性上樣，并收集一維制備組分，濃縮稱重，進(jìn)行液相色譜分析。

1.5.2 第一維分離組分液相色譜分析

色譜條件與標(biāo)準(zhǔn)品溶液分析條件相同，通過對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品溶液確定3個(gè)化合物的組分。

1.5.3 第二維制備型液相色譜分離

為將組分中的目標(biāo)化合物完全分離，利用高效液相色譜依據(jù)分離度公式考察樣品在3、6、9、12 mg時(shí)的上樣量對(duì)目標(biāo)化合物分離度的影響。利用公式(1)將上樣量放大至制備色譜中。

R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)

(2)

式(2)中：R為分離度，tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間，min；tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間，min；W1、W2為此相鄰兩峰的峰寬。

一維色譜分離的組分經(jīng)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品溶液后確定目標(biāo)化合物所在組分，將對(duì)應(yīng)組分進(jìn)行二維制備型液相色譜制備，制備液相色譜參數(shù)：C18色譜柱(50 mm×250 mm，10 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，體積流量100 mL/min，洗脫梯度見表1條件1。

1.6 純度檢測(cè)

使用高效液相色譜對(duì)二維制備分離所得化合物進(jìn)行純度檢測(cè)，所用色譜條件與標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜條件相同。C18色譜柱，乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫條件見表1梯度條件1，體積流量為1.0 mL/min。

1.7 制備型離線二維液相色譜峰容量評(píng)價(jià)

根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法，利用在離線二維液相色譜制備分離過程中獲得的色譜信息，對(duì)第一維色譜柱和第二維色譜柱和整體離線二維色譜體系進(jìn)行峰容量和正交度評(píng)價(jià)。以評(píng)估制備型離線二維液相色譜對(duì)熱毒寧注射液的理論分離能力，以及上樣量和分離時(shí)間等因素對(duì)分離能力的影響。

1.8 制備型離線二維液相色譜正交度評(píng)價(jià)

根據(jù)文獻(xiàn)[19]的方法，利用二維色譜分離過程的色譜峰保留時(shí)間，進(jìn)行二維色譜的正交度評(píng)價(jià)。使用Z+、Z-、Z1、Z24條直線構(gòu)建分離空間，其中Z+、Z-為兩條交叉的斜線，Z1、Z2分別為一條垂直線和一條水平線。二維色譜分離的正交度由這4個(gè)參數(shù)決定，而這些參數(shù)由分離過程中的色譜峰保留時(shí)間決定。

2 結(jié)果與討論

2.1 二維色譜分離條件的選擇

熱毒寧注射液3個(gè)色譜條件的分離色譜圖如圖2所示。整理3個(gè)色譜圖中的色譜峰保留時(shí)間和峰寬，峰容量結(jié)果如表2所示。

(a) C18乙腈(A)-水(B)

表2 3種分離方法的分離參數(shù)及性能

由圖2可以看出，由于C18填料與Xion填料分離機(jī)理不同，色譜峰出峰順序不同，而C18分離的出峰順序大致相同。以乙腈-水為流動(dòng)相經(jīng)C18分離熱毒寧注射液的理論峰容量為67，Xion的理論峰容量為59，以乙腈-甲酸水經(jīng)C18分離熱毒寧注射液的理論峰容量為132。以乙腈水為流動(dòng)相的C18和Xion分離在峰容量上并無顯著區(qū)別；在乙腈-甲酸水的C18分離中加入甲酸改變了流動(dòng)相的pH，使熱毒寧注射液中的酸性化合物和堿性化合物在反相色譜柱中形成不同的保留作用，使原來難以分開的色譜峰得到分離，所以增加了峰容量。

在二維色譜的實(shí)際峰容量和正交度計(jì)算中，Xion與C18的組合的實(shí)際峰容量和正交度均小于C18與C18組合的實(shí)際峰容量。因此，選擇實(shí)際峰容量和正交度相對(duì)較高的乙腈-水C18色譜條件和乙腈甲酸水C18色譜條件的二維色譜組合。

2.2 制備型二維液相色譜分離制備結(jié)果

2.2.1 第一維動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)制備色譜分離結(jié)果

圖3為熱毒寧注射液一維分離色譜圖。根據(jù)色譜峰情況，將熱毒寧注射液分為10個(gè)組分。其中，各組分質(zhì)量分別為R1 4.28 g，R2 4.52 g，R3 10.37 g，R4 9.39 g，R5 22.39 g，R6 5.57 g，R7

圖3 熱毒寧注射液一維制備HPLC圖

9.34 g，R8 1.67 g，R9 0.37 g，R10 7.06 g。

2.2.2 第一維制備分離組分分析

利用高效液相色譜對(duì)R1～R10組分進(jìn)行分析，如圖4所示。R3、R5、R7組分中含有純度較高的綠原酸(1)、梔子苷(2)和斷氧化馬錢子苷(3)，利用第二維制備型液相色譜從中分離出目標(biāo)化合物。

圖4 第一維制備液相色譜10個(gè)組分的分離色譜圖

2.2.3 第二維制備型液相色譜分離結(jié)果

由表3可以看出，對(duì)于R3、R5、R7組分的1、2、3號(hào)色譜峰，上樣量為12 mg時(shí)，3個(gè)組分中對(duì)應(yīng)化合物的分離度均小于1.50，說明此時(shí)的上樣量已超過色譜柱最大吸附分配能力。但在上樣量為3、6、9 mg時(shí)，分離度變化不大。當(dāng)R<1.00時(shí)，兩峰有部分重疊；當(dāng)R=1.00時(shí)，兩峰基本分離；R≥1.50時(shí)完全分離。因此，在R相差不大的情況下選擇上樣量9 mg為液相色譜條件。根據(jù)公式(1)放大至制備型液相色譜中上樣量為1 g，并在制備色譜中制備對(duì)應(yīng)組分。

表3 制備型液相色譜上樣量

2.3 化合物純度分析結(jié)果

如圖5所示，使用對(duì)照品溶液的高效液相色譜法對(duì)化合物進(jìn)行純度檢測(cè)，化合物1、2、3的純度均大于98%，且質(zhì)量分別為2.2、5.9、1.2 g，得率分別為2.8%、7.4%、1.5%(占熱毒寧注射液總量)。根據(jù)保留時(shí)間可以判斷二維色譜所分離化合物分別為綠原酸(圖5(a))、梔子苷(圖5(b))和斷氧化馬錢子苷(圖5(c))。

(a) 綠原酸

2.4 制備型離線二維液相色譜峰容量和正交度評(píng)價(jià)

通過對(duì)二維色譜分離過程中色譜峰信息的采集，計(jì)算二維色譜分離熱毒寧注射液的峰容量和正交度，如表4所示。本實(shí)驗(yàn)中上樣量對(duì)峰容量的計(jì)算基本沒有影響，保持在1.000 0左右，說明本實(shí)驗(yàn)完全避免上樣速度不足或上樣量過大的問題；其次，在制備型二維色譜分離過程中，一維色譜制備后的組分進(jìn)行二維色譜分離制備，使原來譜圖中的一個(gè)色譜峰分離為幾個(gè)色譜峰，增加了峰容量。這也是二維色譜峰容量高于一維色譜峰容量的原因。本實(shí)驗(yàn)中，C18與C18的二維色譜組合提供了856的色譜峰容量和25%的正交度，具有完全分離綠原酸、梔子苷和斷氧化馬錢子苷的能力。

表4 制備型離線二維液相色譜峰容量和正交度評(píng)價(jià)

3 結(jié) 論

在熱毒寧注射液質(zhì)量評(píng)價(jià)中，高純度的化合物單體對(duì)于質(zhì)量評(píng)價(jià)和藥效作用評(píng)價(jià)具有至關(guān)重要的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建制備型離線二維液相色譜，建立可同時(shí)分離熱毒寧注射液3種有效成分的方法，并可將化合物制備至98%的純度。同時(shí)，在二維色譜分離制備過程中，上樣量的考察，確保了第二維制備型液相色譜分離目標(biāo)化合物的分離度，也提高了整個(gè)二維色譜的峰容量。結(jié)果證明本實(shí)驗(yàn)所用方法較實(shí)驗(yàn)室一維色譜分離方法[20]化合物產(chǎn)量高，回收率高，并且由于其良好的峰容量和正交度，具有完全分離出熱毒寧注射液中高純度的梔子苷、綠原酸和斷氧化馬錢子苷的能力，為熱毒寧注射液的質(zhì)量再評(píng)價(jià)提供了技術(shù)基礎(chǔ)。