閆曉華，劉瑞磊，彭寶相，張紀(jì)云 ，孫運(yùn)芳，程振娜

(1山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，山東 臨沂 276000；2臨沂市人民醫(yī)院；3臨沂市腫瘤醫(yī)院)

急性白血病(Acute leukemia，AL)分為急性髓細(xì)胞白血病(Acute myeloid leukemia，AML)和急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia，ALL)，是一類死亡率較高的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。近年來(lái)，其發(fā)病率逐漸增高，主要誘發(fā)因素有物理、化學(xué)、生物及遺傳因素等。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族成員，有研究顯示其在腫瘤防御方面有一定作用。本研究探討TRAIL與AL的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月—2020年5月本院就診及住院的85例AL患者為AL組，其中男52例，女33例；年齡18～67歲，平均(41.1±11.9)歲；AML 51例，ALL 34例。納入標(biāo)準(zhǔn)：均為原發(fā)性病變；采樣前均未經(jīng)放療及化療。另選同期來(lái)本院的體檢者80例作為對(duì)照組，其中男50例，女30例，年齡18歲～65歲，平均(40.3±12.6)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)照組血常規(guī)、尿常規(guī)、糞便常規(guī)、生化檢查、影像學(xué)檢查均為正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：兩組均排除合并心、腦、肝、腎、肺及免疫性疾病患者。所有研究對(duì)象間無(wú)血緣關(guān)系，兩組年齡、性別比等無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具可比性。所有參與研究者均經(jīng)知情同意。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 空腹采血4 ml分置2管中，其中1管為EDTA抗凝血2 ml，-20℃保存；另1管為肝素抗凝血2 ml，離心取血清，-20℃保存。

1.2.2儀器與試劑 PCR試劑、全血基因組DNA提取試劑盒(Tiangen 公司)，限制性內(nèi)切酶(Tas I、Rsa I，F(xiàn)ermentas公司)，紫外顯像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-tech公司)。

1.2.3TRAIL基因多態(tài)性分析 ①基因組DNA的提取：按照試劑說(shuō)明提取全血基因組DNA，提取產(chǎn)物通過(guò)核酸濃度檢測(cè)儀和瓊脂糖凝膠(EB)電泳驗(yàn)證。②PCR擴(kuò)增目的基因片段：上游引物5′-AACATCTTCT-GTCTTTATAATC-3′，下游引物5′-AAATAACACGTACTTACTGAAG-3′(上海博亞公司)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為484 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。③等位基因及基因型分析：基因測(cè)序：由于無(wú)法獲得1588位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶，因此所有PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析(上海生工生物工程有限公司)。PCR-RFLP法分析基因：隨機(jī)抽取20份PCR產(chǎn)物限制性內(nèi)切酶分析，并與測(cè)序結(jié)果比對(duì)。1525位點(diǎn)用Rsa I 酶切，1595位點(diǎn)用Tas I 酶切。酶切產(chǎn)物均用2.5%瓊脂糖凝膠電泳及紫外顯像系統(tǒng)分析。

1.2.4血清sTRAIL水平的檢測(cè) 所有肝素抗凝標(biāo)本離心取血清，使用ELISA法檢測(cè)血清sTRAIL濃度。

2 結(jié)果

2.1Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn) TRAIL基因1525G/A、1588G/A、1595C/T位點(diǎn)基因型的理論分布頻率采用直接計(jì)算法，期望值與觀察值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.449，P=0.799)，達(dá)到遺傳平衡，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所選樣本具備群體代表性。

2.2TRAIL基因多態(tài)性 1525G/A位點(diǎn)經(jīng)Rsa I酶切，電泳可見(jiàn)3組電泳條帶：AA基因型(286、187、11 bp)、GA基因型(473、286、187、11 bp)和GG基因型(473、11 bp)，見(jiàn)圖1；1595C/T位點(diǎn)經(jīng)Tas I酶切，電泳出現(xiàn)3組電泳條帶：CC基因型(291、193 bp)、CT基因型(291、193、131、62 bp)和TT基因型(291、131、62 bp)，見(jiàn)圖2。所選樣本酶切結(jié)果基因序列與測(cè)序結(jié)果一致，且均與GenBank序列一致。

A 圖1 Rsa I酶切產(chǎn)物電泳圖(1525位點(diǎn))注：1.2000 bp DNA Marker；2.PCR產(chǎn)物；3.AA 基因型;4.PCR產(chǎn)物；5.2000 bp DNA Marker

B 圖2 Tas I酶切產(chǎn)物電泳圖(1595位點(diǎn))注：1.CC基因型；2.CT基因型；3.TT基因型; 4.GA基因型；5.GG基因型

2.3兩組基因型與等位基因的比較 AL組TRAIL基因第五外顯子3＇-UTR區(qū)1525(G/A)、1588(G/A)、1595(C/T)三位點(diǎn)基因型和等位基因一致，即三位點(diǎn)突變情況完全一致；兩組TRAIL基因第五外顯子3’-UTR區(qū)1525(G/A)、1588(G/A)、1595(C/T)基因型及等位基因分布不一致。見(jiàn)表1。

表1 兩組基因型與等位基因比較[ n(%)]

2.4兩組血清sTRAIL水平比較 對(duì)照組血清sTRAIL水平高于AL組；按照白血病細(xì)胞系列歸屬分為AML組和ALL組，AML組血清sTRAIL水平與ALL組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 兩組血清sTRAIL水平比較

3 討論

本研究顯示AL組與對(duì)照組TRAIL基因的1525G/A、1588G/A及1595C/T基因型分布不同，AL組1525G、1588G及1595C等位基因頻率明顯高于對(duì)照組，提示TRAIL基因第五外顯子3＇-UTR區(qū)攜帶1525G/1588G/1595C罹患AL的風(fēng)險(xiǎn)增高。AL組血清sTRAIL濃度明顯高于對(duì)照組，AML組與ALL組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究結(jié)果與筆者以前對(duì)TRAIL在實(shí)體瘤中表達(dá)結(jié)果不一致[1-3]，提示實(shí)體瘤與血液惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的差異性。本研究AL患者血清TRAIL表達(dá)量升高，推測(cè)可能由于AL患者TRAIL死亡受體(DR)表達(dá)降低或其他誘導(dǎo)凋亡途徑受阻，導(dǎo)致白血病細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。有研究認(rèn)為，雖然TRAIL mRNA在AML原始細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，但由于自身表面死亡受體低表達(dá)，使AML原始細(xì)胞均對(duì)TRAIL抵抗，進(jìn)而限制了TRAIL的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)[4]。Cappellini A等[5]通過(guò)檢測(cè)AML白血病細(xì)胞TRAIL受體發(fā)現(xiàn)，死亡受體DR4、DR5表達(dá)較少，而誘騙受體DcR-1、DcR-2高表達(dá)，因此引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。目前，有關(guān)TRAIL與AL的研究多涉及如何結(jié)合藥物提高TRAIL死亡受體的表達(dá)，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，起到治療AL的目的[6-7]。

綜上所述，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了TRAIL存在AL的易感基因及AL患者血清sTRAIL水平上升，對(duì)AL的早期預(yù)防及靶向治療研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。