曹 穩(wěn), 洪 亮, 楊 明, 李紹平*, 趙 靜*

(1. 澳門大學(xué)中藥質(zhì)量研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 澳門 999078; 2. 江西國(guó)藥有限責(zé)任公司, 江西 南昌 330096)

發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉(fermentedCordycepspowder)是從天然冬蟲(chóng)夏草中分離出的蟲(chóng)草菌經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)所得菌絲體的干燥粉末[1]。發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉的主要化學(xué)成分與冬蟲(chóng)夏草類似,但價(jià)格相對(duì)較低,常作為天然蟲(chóng)草的替代品[2-4],具有補(bǔ)益肺腎、秘精益氣的功效[5]。市面上以發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉為原料的制劑有金水寶膠囊、百令膠囊、寧心寶膠囊、心肝寶膠囊等[6]。核苷類成分是發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉中的關(guān)鍵成分,2020版《中國(guó)藥典》中收載的發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉制劑金水寶片/膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定以鳥(niǎo)苷、腺苷、尿苷的總含量作為評(píng)價(jià)相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn),百令膠囊以腺苷含量作為測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)[1]。但發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉中除上述3種核苷類成分外,還有許多其他的核苷類成分[7],這些成分對(duì)于菌粉和相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)的影響尚未被討論。因此,本文希望通過(guò)對(duì)發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉及產(chǎn)品中核苷類成分的分析,探討其質(zhì)控指標(biāo)選擇的合理性。

中藥指紋圖譜能充分反映中藥的化學(xué)成分信息,具有整體性和全面性,是評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的常用方法[8-11]。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法可以對(duì)指紋圖譜信息進(jìn)行處理,結(jié)合多個(gè)指標(biāo)對(duì)中藥質(zhì)量進(jìn)行分類和綜合評(píng)價(jià),其中常用的有聚類分析和主成分分析[12-14]。在對(duì)指紋圖譜的分析中,本文首次在主成分分析中引入權(quán)重計(jì)算來(lái)獲得發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉共有峰的權(quán)重值,以權(quán)重值的大小選擇其中的指標(biāo)性成分。在得到指標(biāo)性成分后,使用聚類分析進(jìn)一步驗(yàn)證指標(biāo)性成分能否代替共有峰實(shí)現(xiàn)對(duì)不同的樣品的區(qū)分,從而判斷指標(biāo)性成分的選擇是否可信。

本文采用超高效液相色譜-紫外檢測(cè)法建立了發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉和市面上3種膠囊產(chǎn)品的指紋圖譜,測(cè)定了其中9種核苷類成分的含量。通過(guò)化學(xué)模式識(shí)別對(duì)指紋圖譜進(jìn)行評(píng)價(jià),并結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)提供了一種新的分析、驗(yàn)證指標(biāo)性成分的方法,為發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉和產(chǎn)品的質(zhì)控指標(biāo)選擇提供了科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Ultimate 3000超高效液相色譜系統(tǒng),包括自動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣機(jī)、四元梯度泵、柱溫箱和UV檢測(cè)器(Thermo,美國(guó));加壓溶劑萃取儀(Dionex,美國(guó));超聲清洗儀(Branson,美國(guó));十萬(wàn)分之一分析天平(Mettler Toledo,瑞士); Milli-Q Direct一體化超純水機(jī)(Millipore,德國(guó))。

對(duì)照品尿嘧啶(uracil)、胞苷(cytidine)、鳥(niǎo)嘌呤(guanine)、胸苷(thymidine)、尿苷(uridine)、腺嘌呤(adenine)、肌苷(inosine)(純度≥99%, Sigma-Aldrich,美國(guó)),鳥(niǎo)苷(guanosine)、腺苷(adenosine)(純度≥98%, 北京索萊寶有限科技公司),甲醇(色譜純,Merck,德國(guó))。

發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉原料10批(依次標(biāo)記為S1～S10)，心肝寶膠囊3批(批號(hào):18190401、18200402、18200401，依次標(biāo)記為S11～S13，河北長(zhǎng)天藥業(yè)有限公司)，百令膠囊3批(批號(hào):1911366、1908318、1907333，依次標(biāo)記為S14～S16，杭州中美華東制藥有限公司)，寧心寶膠囊3批(批號(hào):200401、200402、200103，依次標(biāo)記為S17～S19，上海普康藥業(yè)有限公司)，每個(gè)膠囊產(chǎn)品取20粒，分別混合均勻后作為待測(cè)樣品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1色譜條件

采用Agilent Eclipse Plus C18分析柱(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm),柱溫25 ℃,流速1.0 mL/min,流動(dòng)相甲醇(A)和水(B)。梯度洗脫程序:0～8.0 min, 0%A; 8.0～8.5 min, 0%A～5%A; 8.5～20.0 min, 5%A～25%A; 20.0～22.0 min； 25%A～100%A。進(jìn)樣量5 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。

1.2.2對(duì)照品溶液制備

分別稱取對(duì)照品適量,精密稱定,加水溶解制成質(zhì)量濃度為10.7 mg/L尿嘧啶、3.8 mg/L胞苷、10.4 mg/L鳥(niǎo)嘌呤、51.8 mg/L尿苷、10.1 mg/L腺嘌呤、2.1 mg/L肌苷、40.6 mg/L鳥(niǎo)苷、3.7 mg/L胸苷、50.5 mg/L腺苷的對(duì)照品溶液。

1.2.3供試品溶液制備

取樣品粉末0.5 g,精密稱定。加入水25 mL,稱量。超聲(功率881 W,頻率43 kHz)處理10 min,放冷,加水補(bǔ)足減少的質(zhì)量,以3 000 r/min離心15 min,取上清液過(guò)0.45 μm濾膜待用。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取方法的考察

分別采用超聲輔助提取法和加壓溶劑萃取法提取發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉樣品,在優(yōu)化條件下,兩種提取方法得到的9種核苷含量無(wú)顯著差異(見(jiàn)圖1a)。由于超聲輔助提取樣品的操作更為簡(jiǎn)單,且超聲提取儀器更常見(jiàn)[15],因此選擇超聲輔助提取作為樣品的提取方法。同時(shí)實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲提取時(shí)間進(jìn)行了考察(10、20、30、40 min),結(jié)果顯示,不同超聲提取時(shí)間得到的核苷含量無(wú)顯著差異(見(jiàn)圖1b)。因此選擇室溫下超聲輔助提取10 min作為樣品的提取條件,并以此條件提取全部樣品。

圖1 不同(a)提取方法和(b)超聲提取時(shí)間對(duì)樣品中核苷峰面積的影響Fig. 1 Effect of different (a) extraction methodsand (b) ultrasound time on the peak areas of nucleosides in the samples

2.2 方法學(xué)考察

分別精密吸取適量對(duì)照品溶液,加水稀釋成5個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液,按1.2.1節(jié)方法進(jìn)樣測(cè)定,以峰面積(Y)對(duì)對(duì)照品質(zhì)量濃度(X, mg/L)進(jìn)行線性回歸。9個(gè)組分在各自的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸系數(shù)(R2)均不小于0.999(見(jiàn)表1)。

表1 9個(gè)核苷成分的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)

取混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定檢測(cè)系統(tǒng)精密度;取發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉1號(hào)樣品,按1.2.3節(jié)方法平行制備供試品溶液6份,進(jìn)樣測(cè)定重復(fù)性;分別在供試品溶液制備后0、4、8、12和24 h進(jìn)樣,測(cè)定樣品穩(wěn)定性;精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)中9個(gè)組分相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.0%,相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%,表明儀器的精密度、方法的重復(fù)性、樣品的穩(wěn)定性良好。

取發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉樣品6份,分別精密加入與樣品等量的肌苷、胞苷、胸苷、尿嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷、尿苷、腺苷對(duì)照品,按優(yōu)化的超聲提取法處理,進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率。各核苷組分的平均回收率為95.6%～101.2%,表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.3 含量測(cè)定

將19批發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉及產(chǎn)品分別按1.2.3節(jié)方法制備供試品溶液,按1.2.1節(jié)的色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定,其中9種混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖見(jiàn)圖2a, 1號(hào)樣品的色譜圖見(jiàn)圖2b。依據(jù)保留時(shí)間鑒定樣品中各核苷成分,并記錄260 nm波長(zhǎng)下各成分的色譜峰面積。按外標(biāo)一點(diǎn)法分別計(jì)算各組分的含量,結(jié)果見(jiàn)附表1(詳見(jiàn)http://www.chrom-China.com)。不同產(chǎn)品中各核苷成分的含量區(qū)別較大,但尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷的含量均比較高。

圖2 (a)混合對(duì)照品溶液及(b)1號(hào)發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉樣品的指紋圖譜Fig. 2 Fingerprints of (a) the mixed standard solution and(b) No. 1 fermented Cordyceps powder sample 1. uracil; 2. cytidine; 3. guanine; 4. uridine; 5. adenine; 6. inosine; 7. guanosine; 8. thymidine; 9. adenosine.

2.4 指紋圖譜的建立

將19批發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉及產(chǎn)品的色譜圖導(dǎo)入至“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.1版本)”軟件進(jìn)行處理,生成對(duì)照指紋圖譜(R)和樣品的指紋圖譜(見(jiàn)圖3)。19批發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉樣品的色譜圖中共識(shí)別出16個(gè)主要的共有特征峰,根據(jù)對(duì)照品將9個(gè)共有峰分別鑒定為尿嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鳥(niǎo)苷、胸苷、腺苷,樣品的各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%,共有指紋峰的峰面積百分比大于99%。

圖3 發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉樣品及產(chǎn)品的指紋圖譜Fig. 3 Fingerprints of fermented Cordyceps powder samples and products R: reference fingerprint; S1-S10: fermented Cordyceps powder; S11-S13: Xinganbao capsule; S14-S16: Bailing capsule; S17-S19: Ningxinbao capsule. Peaks 1-9 were the same as that in Fig. 2.

2.5 指紋圖譜評(píng)價(jià)

2.5.1指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.1版本)”軟件,將對(duì)照?qǐng)D譜作為參照?qǐng)D譜,計(jì)算19批發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉及產(chǎn)品指紋圖譜的相似度。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%, 19批樣品的相似度均大于0.9,相似度結(jié)果見(jiàn)表2。要進(jìn)一步分析其中的代表性成分,須進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別。

表2 19批發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉樣品及產(chǎn)品的相似度

2.5.2主成分分析

采用MATLAB軟件,將共有峰的峰面積數(shù)據(jù)作為變量,分別對(duì)發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉和3種產(chǎn)品各自進(jìn)行主成分分析,并計(jì)算每個(gè)成分的權(quán)重值。權(quán)重值代表該成分峰對(duì)主成分的貢獻(xiàn),權(quán)重值越高,對(duì)主成分貢獻(xiàn)越大,將權(quán)重值大于0.1的成分作為樣品的指標(biāo)性成分。經(jīng)分析，各樣品中指標(biāo)性成分如下:發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉原料中的尿苷(0.24)、鳥(niǎo)苷(0.14)、腺苷(0.14)、尿嘧啶(0.10);心肝寶膠囊樣品中的腺苷(0.20)、尿苷(0.18)、鳥(niǎo)苷(0.17)、尿嘧啶(0.12); 百令膠囊樣品中的尿嘧啶(0.19)、鳥(niǎo)苷(0.18)、腺嘌呤(0.16)、腺苷(0.14)、尿苷(0.10);寧心寶膠囊樣品中的尿嘧啶(0.22)、腺苷(0.21)、腺嘌呤(0.20)、尿苷(0.10)、鳥(niǎo)苷(0.10)。

對(duì)19個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行主成分分析,其主成分分析得分圖顯示,19個(gè)樣品可分為5類(見(jiàn)圖4),分別為:S1～S5、S6～S10、S11～S13、S14～S16和S17～S19。其中S1～S10為10批發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉樣品,由兩種發(fā)酵工藝制得,不同工藝得到的產(chǎn)品質(zhì)量存在差異,因此聚為兩類;S11～S13、S14～S16和S17～S19分別為心肝寶膠囊、百令膠囊、寧心寶膠囊3種產(chǎn)品,來(lái)自不同廠家,其生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)環(huán)境不同,均會(huì)造成產(chǎn)品之間的差異。而同種產(chǎn)品不同批次之間的一致性較好,因此各產(chǎn)品單獨(dú)聚為一類。對(duì)19批樣品同時(shí)進(jìn)行權(quán)重計(jì)算,有5個(gè)成分權(quán)重值大于0.1,分別為:尿苷(0.28)、鳥(niǎo)苷(0.14)、尿嘧啶(0.13)、腺苷(0.10)、腺嘌呤(0.10),即這些成分可以作為區(qū)別全部樣品的指標(biāo)成分。

圖4 發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉樣品及產(chǎn)品的主成分分析得分圖Fig. 4 Scores of principal component analysis forfermented Cordyceps powder samples and products FJ1: fermented Cordyceps powder (S1-S5); FJ2: fermented Cordyceps powder (S6-S10); XGBJN: Xinganbao capsule (S11-S13); BLJN: Bailing capsule (S14-S16); NXBJN: Ningxinbao capsule (S17-S19).

2.5.3聚類分析

將19批樣品的共有峰峰面積作為變量,導(dǎo)入SPSS軟件中進(jìn)行聚類分析,結(jié)果見(jiàn)圖5a。由結(jié)果可知,19批樣品可聚為5類,與主成分分析結(jié)果一致。同時(shí),使用主成分分析中篩選出的5個(gè)指標(biāo)成分對(duì)19批樣品進(jìn)行聚類分析,得到的結(jié)果如圖5b,與使用全部共有峰進(jìn)行聚類分析的結(jié)果一致,說(shuō)明僅使用這5種指標(biāo)成分就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同的發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉和產(chǎn)品的區(qū)分。

圖5 發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉樣品及產(chǎn)品的(a)共有峰及(b)指標(biāo)成分的聚類分析樹(shù)狀圖Fig. 5 Cluster analysis dendrograms for (a) commonpeaks and (b) index components of fermented Cordyceps powder samples and products

3 結(jié)論

本文建立了一種發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉原料和市場(chǎng)上3種主要產(chǎn)品的指紋圖譜,得到了16個(gè)共有峰,測(cè)定了其中9個(gè)核苷的含量,并結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析得到了指標(biāo)性成分,分別為尿苷、鳥(niǎo)苷、腺苷、腺嘌呤、尿嘧啶。以上結(jié)果表明,該方法可以定量分析發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉中多種核苷成分。同時(shí),利用液相色譜指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別,可以分析與評(píng)價(jià)發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉及產(chǎn)品中的指標(biāo)性成分,為其質(zhì)量控制提供簡(jiǎn)單、可靠的方法。將該分析方法進(jìn)一步擴(kuò)展,可以為其他中藥指紋圖譜的建立、指標(biāo)成分的分析提供參考,為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。