吳毅 劉雅芳 張昆 王飛

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（Post?operative cognitive dysfunction，POCD）嚴(yán)重降低生活質(zhì)量并與死亡率增加有關(guān)聯(lián)，而神經(jīng)元凋亡是導(dǎo)致POCD 的重要病理基礎(chǔ)。已有研究表明老年小鼠在遭遇手術(shù)創(chuàng)傷后出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡增加與學(xué)習(xí)記憶功能手術(shù)［1］。右美托咪定（Dex）是一種高選擇性α2 腎上腺素能受體激動(dòng)劑，具有劑量依賴性催眠和鎮(zhèn)靜作用。右美托咪定可減輕過度的神經(jīng)元炎癥反應(yīng)，從而減緩術(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生于發(fā)展［1］。進(jìn)一步的動(dòng)物研究表明，右美托咪定通過激活PGC?1α 途徑降低氧化應(yīng)激并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［3］，提示右美托咪定在認(rèn)知功能障礙中具有良好的治療作用。而右美托咪定發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用是否與其抑制海馬神經(jīng)元凋亡有關(guān)，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過對(duì)老年小鼠行剖腹探查術(shù)誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡模型，研究右美托咪定對(duì)老年小鼠剖腹探查術(shù)所致神經(jīng)元凋亡的影響，以期為防治POCD 提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL∕6 小鼠（雄性，16 月齡，28-32 g）購(gòu)自廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物所處的飼養(yǎng)環(huán)境為SPF 級(jí)凈化空間，并可以自由地獲得水和食物。在實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)動(dòng)物實(shí)施的所有操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。共有40 只小鼠被納入本研究。

1.2 主要試劑與儀器 右美托咪定（江蘇恒瑞）、cleaved?caspase 3 抗體（Abcam）、calpain 2 抗 體（Cell signaling）、Bax 抗 體（Abcam）、Bcl?2 抗 體（Abcam 生物技術(shù)公司）、GAPDH 抗體（Abcam）、TUNEL 熒光染色試劑盒（Promega）。

1.3 研究方法 （1）動(dòng)物與分組：將40 只16 月齡的C57BL∕6 老年小鼠隨機(jī)分成4 組：控制對(duì)照組（Con 組）、右美托咪定組（Dex 組）、手術(shù)組（Surgery組）、右美托咪定+手術(shù)組（Dex+Surgery 組），每組10 只。Con 組腹腔注射等體積0.9%生理鹽水。

Dex 組腹腔注射25 μg∕kg 右美托咪定。Surgery 組行剖腹探查術(shù)。Dex+Surgery 組在行剖腹探查術(shù)前20 分鐘預(yù)先腹腔注射25 μg∕kg 右美托咪定。手術(shù)結(jié)束后6 小時(shí)，每組各取5 只老年小鼠，使用TU?NEL 試劑盒檢測(cè)海馬各區(qū)的神經(jīng)元凋亡情況。另外，在手術(shù)結(jié)束后6 小時(shí)，每組再各取5 只老年小鼠，分離出海馬組織，用Western blot 法檢測(cè)海馬凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase?3、calpain 2、Bax、Bcl?2的表達(dá)情況。（2）剖腹探查術(shù)：首先我們用1.5%異氟醚復(fù)合2 升∕分鐘氧氣對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉。對(duì)小鼠腹部消毒后，在腹部中線作1 至2 厘米的切口。隨后，對(duì)腹腔內(nèi)腸和內(nèi)臟等進(jìn)行探查。整個(gè)手術(shù)過程在異氟醚麻醉下進(jìn)行，持續(xù)時(shí)間大約30 分鐘。

1.3 檢測(cè)方法 TUNEL 染色首先將海馬切片置于二甲苯中進(jìn)行脫蠟，放入不同濃度梯度（100%，90%，70%）的酒精中各浸泡5 分鐘。然后使用蛋白酶K 工作液在室溫下作用10 分鐘，每個(gè)切片樣本中分別加入50 μl 的酶反應(yīng)液于濕盒中孵育60分鐘。孵育完畢后，于切片中滴加DAPI 染色液作用5 分鐘后于熒光顯微鏡下進(jìn)行拍攝。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Graph?pad Prism 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（）表示。對(duì)于組間的差異采用Turkey 法進(jìn)行兩兩比較，對(duì)于服從正態(tài)分布的計(jì)量資料，采用單因素方差分析檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí)被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 右美托咪定減輕剖腹探查術(shù)誘導(dǎo)的老年小鼠海馬神經(jīng)元凋亡 見圖1。

2.1 右美托咪定對(duì)剖腹探查術(shù)導(dǎo)致的老年小鼠海馬cleaved caspase?3 表達(dá)水平的影響 見圖2。

圖2 右美托咪定對(duì)剖腹探查術(shù)導(dǎo)致的老年小鼠海馬cleaved caspase?3 表達(dá)水平的影響

2.3 右美托咪定對(duì)剖腹探查術(shù)導(dǎo)致的的老年小鼠海馬calpain 2 表達(dá)水平的影響 見圖3。

圖3 右美托咪定對(duì)剖腹探查術(shù)導(dǎo)致的老年小鼠海馬calpain 2 表達(dá)水平的影響

2.4 右美托咪定對(duì)剖腹探查術(shù)導(dǎo)致的老年小鼠海馬Bax 和Bcl?2 表達(dá)水平的影響 見圖4。

圖4 右美托咪定對(duì)剖腹探查術(shù)導(dǎo)致的老年小鼠海馬Bax 和Bcl?2 表達(dá)水平的影響

3 討 論

3.1 右美托咪定減輕手術(shù)所致神經(jīng)元凋亡 近期的研究表明，外周手術(shù)可誘發(fā)神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致大量神經(jīng)元凋亡，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能受損［4］。本研究通過建立老年小鼠行剖腹探查術(shù)的模型，發(fā)現(xiàn)右美托咪定能減輕剖腹探查術(shù)所致神經(jīng)元凋亡，并且逆轉(zhuǎn)剖腹探查術(shù)誘導(dǎo)的cleaved caspase?3、calpain 2 和Bax 的表達(dá)上調(diào)以及Bcl?2 的表達(dá)下降。

3.2 右美托咪定能發(fā)揮多種神經(jīng)保護(hù)作用 最近的研究表明，右美托咪定除了眾所周知的催眠和鎮(zhèn)靜作用外，還可能有其他保護(hù)作用。在阿爾茲海默癥（Alzheimer's disease，AD）動(dòng)物模型中，右美托咪定可以保護(hù)神經(jīng)元免受變性，而此過程可能與抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)［5］。鑒于手術(shù)可導(dǎo)致老齡小鼠海馬神經(jīng)元凋亡明顯增加，本研究主要探討右美托咪定在手術(shù)誘導(dǎo)的老齡小鼠海馬神經(jīng)元凋亡模型中的作用。

3.3 手術(shù)創(chuàng)傷可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡 手術(shù)創(chuàng)傷可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，而細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加可使凋亡信號(hào)通路激活，進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。目前，已有研究結(jié)果表明細(xì)胞凋亡和calpain 2之間有著密切的關(guān)聯(lián)［6］。本研究發(fā)現(xiàn)剖腹探查術(shù)導(dǎo)致老年小鼠海馬組織TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯升高，并且上調(diào)cleaved caspase?3 和calpain 2 的表達(dá)，提示手術(shù)創(chuàng)傷可同時(shí)激活caspase?3 依賴和非cas?pase?3 依賴的信號(hào)通路導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。

3.4 右美托咪定通過降低Bax/Bcl?2 比例減輕神經(jīng)元凋亡 在AD 動(dòng)物模型中，當(dāng)神經(jīng)元過表達(dá)Bcl?2 時(shí)，凋亡細(xì)胞顯著減少［7］。與以前的研究一致，我們發(fā)現(xiàn)手術(shù)導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡與Bcl?2 表達(dá)減少以及Bax∕Bcl?2 比例增加有關(guān)，右美托咪定通過增加Bcl?2 表達(dá)以及降低Bax∕Bcl?2 比例來(lái)減輕手術(shù)所導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元凋亡，并且可以通過穩(wěn)定促凋亡蛋白來(lái)減輕線粒體孔損傷，從而減少其對(duì)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)的有害影響。

本研究通過建立剖腹探查術(shù)誘導(dǎo)老年小鼠海馬神經(jīng)元凋亡模型，并在手術(shù)前使用右美托咪定預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)右美托咪定預(yù)處理能通過減輕手術(shù)所導(dǎo)致的cleaved caspase?3 和calpain 2 表達(dá)增加以及Bax∕Bcl?2 比值增加，并且明顯減輕剖腹探查術(shù)所導(dǎo)致的老年小鼠海馬神經(jīng)元凋亡?？傮w來(lái)說，本研究結(jié)果為揭示手術(shù)導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡機(jī)制以及防治策略提供新的思路。