姜建萍 楊學明 袁翔 邱慶慶 楊秀榮 蔣欽楊 黃光華 蔣和生

摘要：【目的】克隆羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）淀粉酶基因（AMY），并進行生物學信息分析及其表達規(guī)律研究，為揭示AMY基因的生物學功能及其對羅氏沼蝦生長發(fā)育的調(diào)控作用機理提供理論依據(jù)?！痉椒ā縋CR克隆羅氏沼蝦AMY基因編碼區(qū)（CDS）序列，利用ExPASy ProtParam、ExPASy ProtScale、SignalP-5.0、MegAlign及Lasergene v8.0等在線軟件進行生物信息學分析，應用實時熒光定量PCR檢測AMY基因在羅氏沼蝦不同組織（腹神經(jīng)節(jié)、胃、心臟、鰓組織、性腺、肝胰腺、肌肉和腸道）中的表達情況，并明確其在生長快速家系（FG）和生長慢速家系（SG）個體肌肉中的表達模式?！窘Y果】羅氏沼蝦AMY基因CDS序列全長2121 bp，共編碼706個氨基酸殘基;其編碼蛋白分子量為76.87 kD，理論等電點（pI）為4.63，屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白，包含2個典型的淀粉酶結構域;在羅氏沼蝦AMY蛋白二級結構中，α-螺旋占13.88%，延伸鏈占21.39%，無規(guī)則卷曲占64.73%。羅氏沼蝦AMY氨基酸序列與克氏原螯蝦AMY氨基酸序列的相似性最高（62.6%），與大珠母貝AMY氨基酸序列的相似性較低（48.9%）;基于AMY氨基酸序列相似性構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，羅氏沼蝦與克氏原螯蝦的親緣關系最近，而與中華絨螯蟹的親緣關系較遠。AMY基因在羅氏沼蝦不同組織中廣泛表達，但存在性別差異性和組織特異性，具體表現(xiàn)為：雌性個體腸道中的相對表達量極顯著高于雄性個體（P<0.01，下同），鰓組織中的相對表達量顯著高于雄性個體（P<0.05），而肝胰腺中的相對表達量極顯著低于雄性個體。羅氏沼蝦AMY基因在FG個體肌肉中的相對表達量極顯著高于SG個體?！窘Y論】AMY基因在羅氏沼蝦的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，廣泛表達于羅氏沼蝦的不同組織中，但存在性別差異性和組織特異性。

關鍵詞： 羅氏沼蝦;淀粉酶基因（AMY）;表達規(guī)律;生物信息學分析;生長性狀

中圖分類號： S917.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）05-1362-08

Abstract：【Objective】Macrobrachium rosenbergii amylase gene（AMY） was cloned， biological information analysis and expression regulation were studied， to provide theoretical foundation for further understanding biological function of AMY gene in the growth and development of M. rosenbergii. 【Method】The coding area sequence （CDS） of AMY gene in M. rosenbergii was cloned by PCR. Bioinformatic analysis of AMY sequencing was performed using ExPASy ProtParam， ExPASy ProtScale， SignalP-5.0， MegAlign and Lasergene v8.0 softwares. Real-time fluorescence quantitative PCR （RT-PCR） was used to detect the expression of AMY gene in different tissues（including abdominal ganglion，stomach，heart，gill，gonad，hepatopancreas，muscle and intestine）， and further to explore its expression in the muscle of individuals from fast-growing families（FG） and slow-growing families（SG）. 【Result】The length of CDS of AMY gene was 2121 bp， encoding 706 amino acids residues. The molecular weight of AMY protein was 76.87 kD，and the theoretical isoelectric point（pI） was 4.63，belonging to an unstable hydrophilic protein， which contained two typical amylase domains. The secondary structure of AMY protein was consisted of α-helix，extended strand and random coil，accounting for 13.88%， 21.39% and 64.73%， respectively. The homology of amino acid sequence of AMY gene in M. rosenbergii was the highest（62.6%） and lower（48.9%） compared with the amino acid sequences of Procambarus clarkii and Pinctada maxima，respectively. Phylogenetic tree constructed based on the amino acid sequence similarity of AMY genes howed that M. rosenbergii had the closest genetic relationship with P. clarki， but had the far genetic relationship with Eriocheir sinensis. AMY gene was widely expressed in the different tissues， but with differences between sexes and tissue specificity. The details were as follows：it had the extremely higher expression in the intestines and gills of female individuals than that of male individuals（P<0.01， the same below），it had the significantly higher expression in gill of female individuals than that of male indivi-duals（P<0.05），but the expression in the hepatopancreas of female individuals was lower than that of male individuals. In addition， the expression level of AMY gene in muscle of in FG was extremely higher than that in SG. 【Conclusion】AMY gene plays an important role in growth and development of? M. rosenbergii. It is widely expressed in different tissues of M. rosenbergii， but with sex specificity? and tissue specificity.

Key words：Macrobrachium rosenbergii; amylase gene（AMY）; expression regulation; bioinformatic analysis; growth traits

Foundation item：Guangxi Natural Science Foundation（2018GXNSFBA281209）; Science and Technology Major Project of Guangxi（Guike AA17204080-6）; Guangxi Postdoctoral Fundamental Research Fund（T3340097968）

0 引言

【研究意義】羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）原產(chǎn)于東南亞國家，因具有生長快、食性廣、肉質(zhì)鮮美及養(yǎng)殖周期短等優(yōu)點，現(xiàn)已發(fā)展成為我國重要的淡水養(yǎng)殖品種之一（姜建萍等，2019）。截至2018年，我國羅氏沼蝦產(chǎn)量達13.3萬t（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁政漁業(yè)管理局，2019）。隨著集約化養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，近親繁殖等原因致使羅氏沼蝦種質(zhì)不斷退化，“老頭蝦”“蝎子蝦”現(xiàn)象頻繁出現(xiàn)，嚴重制約了羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，亟待進一步加強羅氏沼蝦遺傳改良以提高羅氏沼蝦養(yǎng)殖效益和健康養(yǎng)殖水平。淀粉酶（Amylase，AMY）是機體內(nèi)重要的消化酶類，在甲殼類動物碳水化合代謝及營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收方面扮演著重要角色（Simon，2009;Karasov and Douglas，2013;Rodríguez-Viera et al.，2017），因此開展羅氏沼蝦AMY基因克隆及其表達規(guī)律分析，對深入探究AMY基因生物學功能和提高羅氏沼蝦遺傳改良及分子輔助育種均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】至今，已有眾多學者針對AMY基因克隆及其生物信息學分析展開了一系列研究，從鱖魚（陳亮等，2009）、斜帶石斑魚（胡永樂等，2010）、大珠母貝（潘俐玲等，2013）、日本囊對蝦（宋曉紅，2014）、九孔鮑（栗志民等，2017）及斑節(jié)對蝦（楊其彬等，2017）等多種水產(chǎn)動物中克隆獲得AMY基因編碼區(qū)（CDS）序列，針對AMY基因的表達模式及其規(guī)律也有較多研究報道。辛靜靜等（2011）研究證實，AMY基因多態(tài)性對凡納濱對蝦的生長性狀有顯著影響，可作為影響凡納濱對蝦生長性狀的候選基因。宋曉紅（2014）研究表明，AMY基因在不同變異類型日本囊對蝦的不同組織中均有表達，以肝胰腺中的相對表達量最高，故推測AMY基因與日本囊對蝦的消化代謝相關。彭濤（2015）通過免疫印跡法和實時熒光定量PCR分析克氏原螯蝦AMY基因的組織表達差異，結果顯示AMY基因在各組織中的表達量差異顯著，以在肝胰腺中的表達量最高，其次是胃組織;經(jīng)蛻皮激素刺激48 h后其表達量明顯下降，說明AMY基因能應答克氏原螯蝦蛻皮激素誘導信號。唐小紅等（2015）研究表明，肝胰臟并不是草魚生成淀粉酶的唯一場所，在其腸道組織中也有AMY基因表達;自出膜72 h仔魚開口攝食之后，AMY基因的表達量明顯增加，故推測攝食能促進草魚AMY基因的表達。栗志民等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，AMY基因在九孔鮑右側殼肌、腸道、肝臟、胃、外套膜、吻和腹足等7種組織中均有不同程度的表達，經(jīng)ANOVA分析顯示消化組織與非消化組織間的AMY基因表達量存在顯著差異，即AMY基因表達量與九孔鮑的生長性狀呈顯著正相關。楊其彬等（2017）研究表明，AMY基因在斑節(jié)對蝦的不同組織及整個生長階段均有表達，且以糠蝦時期的表達量最高，說明AMY基因可能與斑節(jié)對蝦的幼體發(fā)育相關。以上研究證明，AMY基因是水產(chǎn)類動物重要的生長性狀候選基因?！颈狙芯壳腥朦c】至今，關于羅氏沼蝦AMY基因的克隆、生物信息學分析及其表達規(guī)律鮮見研究報道?！緮M解決的關鍵問題】基于NCBI已公布的AMY基因EST序列，克隆羅氏沼蝦AMY基因CDS序列，并進行生物學信息分析及其表達規(guī)律研究，為揭示AMY基因的生物學功能及其對羅氏沼蝦生長發(fā)育的調(diào)控作用機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

5月齡羅氏沼蝦由廣西南寧國家級羅氏沼蝦良種場提供。以肝胰腺為素材，進行AMY基因克隆;分別選取7尾雌/雄羅氏沼蝦采集樣品，包括腹神經(jīng)節(jié)、胃、心臟、鰓組織、性腺、肝胰腺、肌肉和腸道共8個組織，用于AMY基因表達分析;同時采集生長快速家系（FG）和生長慢速家系（SG）中體重和體長極端性狀的雌性羅氏沼蝦肌肉組織（邱慶慶，2019），分別置于液氮中保存?zhèn)溆??？俁NA提取試劑TRIzol、反轉錄試劑盒、凝膠回收試劑盒、pMD18-T載體和Premix Ex TaqTM Ⅱ均購自TaKaRa公司;DL2000 DNA Marker購自廣州東盛生物科技有限公司;Taq PCR Master Mix購自Vazyme公司;大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司。

1. 2 總RNA提取及cDNA合成

采用TRIzol提取羅氏沼蝦樣品總RNA，利用NanoDrop 2000和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度及其完整性，再以PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑合成cDNA。

1. 3 AMY基因克隆及生物信息學分析

根據(jù)GenBank已公布的羅氏沼蝦AMY基因EST序列（KM886337.1），利用AMY-1引物擴增AMY基因CDS序列，PCR反應體系15.0 μL：2×Taq Master Mix 7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，RNase-free ddH2O 5.5 μL。擴增程序：95.0 ℃預變性5 min;95.0 ℃ 30 s，57.6 ℃ 30 s，72.0 ℃ 1 min，進行35個循環(huán);72.0 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用膠回收試劑盒進行目的條帶回收及純化，過夜連接至pMD18-T載體后轉化Trans5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆進行菌液PCR鑒定，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1. 4 AMY基因生物信息學分析

利用ExPASy ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）分析羅氏沼蝦AMY基因編碼蛋白理化性質(zhì);采用ExPASy ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）進行親/疏水性預測;運用SignalP-5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測其信號肽;使用SMART（http：//smart.embl.de/）進行結構域預測;利用MLRC（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_mlrc.html）和SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）分別進行編碼蛋白的二、三級結構預測;并以DNASTAR中的MegAlign和Lasergene v8.0分別進行同源比對及系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析。

1. 5 AMY基因表達分析

基于克隆獲得的AMY基因CDS序列，以18S rRNA序列（DQ642856.1）為內(nèi)參基因（俞炎琴，2013），利用Primer 3（http：//primer3.ut.ee/）和Oligo 7.0設計擴增引物（表1），通過實時熒光定量PCR檢測羅氏沼蝦AMY基因的表達情況。PCR反應體系20.0 μL：Premix Ex Taq? II 10.0 μL，cDNA模板5.0 μL，正、反向引物各0.5 μL，RNase free ddH2O 4.0 μL。擴增程序：95.0 ℃預變性30 s;95.0 ℃ 5 s，60.0 ℃ 30 s，進行40個循環(huán);72.0 ℃延伸5 min，4.0 ℃保存。每個樣品進行3次生物學重復，采用2?ΔΔCt法計算AMY基因的相對表達量（Livak and Schmittgen，2001）。

2 結果與分析

2. 1 羅氏沼蝦AMY基因CDS序列及測序分析結果

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果獲得1條明亮清晰、大小約2000 bp的特異性條帶（圖1），與預期結果相符。測序結果顯示，羅氏沼蝦AMY基因CDS序列全長2121 bp，共編碼706個氨基酸殘基;氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)其與NCBI已發(fā)布羅氏沼蝦（GenBank登錄號KM886337.1）相應氨基酸序列的相似性達99.9%，僅是第251位堿基由A→G，導致第84位酪氨酸（Tyr）突變?yōu)榘腚装彼幔–ys）（圖2）。

2. 2 羅氏沼蝦AMY蛋白理化性質(zhì)預測分析結果

羅氏沼蝦AMY基因編碼蛋白分子量為76.87 kD，理論等電點（pI）為4.63。羅氏沼蝦AMY蛋白的甘氨酸（Gly）含量較高，占總氨基酸數(shù)的12.60%;帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）為83個，帶負電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）為42個，不穩(wěn)定系數(shù)為33.17（屬于不穩(wěn)定蛋白），脂肪數(shù)為59.80;AMY蛋白親水性平均值為-0.398，具有較強的親水性（圖3），與ExPASy ProtParam預測得到的親水性平均系數(shù)（GRAVY=-0.398）一致，故推測羅氏沼蝦AMY蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白。SMART的結構域預測結果表明，羅氏沼蝦AMY蛋白存在信號肽，且信號肽是由AWA-YD組成，其剪切位點分別在第18位和第19位氨基酸殘基間。羅氏沼蝦AMY蛋白還包含2個典型的淀粉酶結構域，即domain A（28Gln～402Arg）和domain C（411Glu～489Gly）。

2. 3 羅氏沼蝦AMY蛋白糖基化位點和磷酸化位點預測結果

羅氏沼蝦AMY蛋白不存在糖基化位點;其磷酸化位點預測結果（圖4）顯示，在AMY肽鏈中可能發(fā)生磷酸化且分值在0.5以上的氨基酸位點有80個，其中，蘇氨酸（Thr）磷酸化位點29個，絲氨酸（Ser）磷酸化位點37個，酪氨酸（Tyr）磷酸化位點14個。由于AMY肽鏈是以絲氨酸磷酸化位點為主，故推測羅氏沼蝦AMY蛋白是以絲氨酸為主、蘇氨酸為輔的磷酸化修飾調(diào)控其生物功能。

2. 4 羅氏沼蝦AMY蛋白二、三級結構預測結果

羅氏沼蝦AMY蛋白二級結構預測結果（圖5）顯示，以無規(guī)則卷曲占比最高（占64.73%），其次是延伸鏈（占21.39%），α-螺旋僅占13.88%。利用SWISS-MODEL預測羅氏沼蝦AMY蛋白可能存在的三級結構，結果如圖6所示。

2. 5 羅氏沼蝦AMY基因同源性比對分析及系統(tǒng)發(fā)育進化樹構建

根據(jù)NCBI已公布的AMY基因EST序列，可知羅氏沼蝦AMY基因CDS序列編碼706個氨基酸殘基。針對羅氏沼蝦（AKL71614.1）、斑節(jié)對蝦（AME17649.1）、凡納濱對蝦（AIJ02079.1）、太平洋牡蠣（CAA69658.1）、褐蝦（AWU67110）、合浦珠母貝（AGN55419.1）、克氏原螯蝦（AXC43909.1）、大珠母貝（AEI58897.1）及中華絨螯蟹（ANG56301.1）的AMY氨基酸序列進行同源比對分析，結果（圖7）顯示，羅氏沼蝦與克氏原螯蝦的相似性最高（62.6%），與大珠母貝的相似性較低（48.9%）?；贏MY氨基酸序列相似性構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖8）顯示，羅氏沼蝦與克氏原螯蝦的親緣關系最近，而與中華絨螯蟹的親緣關系較遠。

2. 6 羅氏沼蝦AMY基因的組織表達差異

如圖9所示，AMY基因在雄性羅氏沼蝦不同組織中的相對表達量以肝胰腺最高，其次是胃，鰓組織的相對表達量最低;在雌性羅氏沼蝦中以肝胰腺的相對表達量最高，其次是胃，而肌肉的相對表達量最低。對比相同組織不同性別個體的AMY基因相對表達量發(fā)現(xiàn)，羅氏沼蝦AMY基因在雌性個體腸道中的相對表達量極顯著高于雄性個體（P<0.01，下同），鰓組織中的相對表達量顯著高于雄性個體（P<0.05），肝胰腺中的相對表達量極顯著低于雄性個體，而腹神經(jīng)節(jié)、胃、心臟、性腺和肌肉中的相對表達量差異不顯著（P>0.05）?？梢?，AMY基因在羅氏沼蝦不同組織中廣泛表達，但存在性別差異性和組織特異性。

2. 7 羅氏沼蝦AMY基因在不同生長速度家系個體中的表達差異

為探究羅氏沼蝦AMY基因在不同生長速度家系個體中的表達規(guī)律，以體重和體長等生長性狀表型值差異極顯著的FG和SG個體為供試材料，實時熒光定量PCR檢測不同生長速度家系個體肌肉中的AMY基因表達情況。由圖10可知，羅氏沼蝦AMY基因在FG個體肌肉中的相對表達量極顯著高于SG個體的相對表達量。

3 討論

AMY是甲殼類動物體內(nèi)主要的消化酶類，對其新陳代謝及生長發(fā)育等活動發(fā)揮著極其重要的作用（陳亮等，2009）。AMY活性對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收效率有顯著影響，進而影響機體的生長發(fā)育（Hidalgo et al.，1999;Huvet et al.，2008;李浩，2018;朱書禮等，2020）。為此，本研究以羅氏沼蝦為研究對象，開展AMY基因克隆并進行生物信息學分析，結果顯示，羅氏沼蝦AMY基因CDS序列全長2121 bp，共編碼706個氨基酸殘基，其編碼蛋白分子量為76.87 kD，理論等電點（pI）為4.63，屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白，包含2個典型的淀粉酶結構域，即domain A（28Gln～402Arg）和domain C（411Glu～489Gly）;羅氏沼蝦AMY氨基酸序列與克氏原螯蝦AMY氨基酸序列的相似性最高，與大珠母貝AMY氨基酸序列的相似性較低;基于AMY氨基酸序列相似性構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，羅氏沼蝦與克氏原螯蝦的親緣關系最近，而與中華絨螯蟹的親緣關系較遠。

本研究對羅氏沼蝦AMY基因的組織表達差異進行分析，發(fā)現(xiàn)AMY基因在羅氏沼蝦不同組織中廣泛表達，但存在性別差異性和組織特異性，具體表現(xiàn)為：雌性個體腸道中的相對表達量極顯著高于雄性個體，鰓組織中的相對表達量顯著高于雄性個體，而肝胰腺中的相對表達量極顯著低于雄性個體。AMY基因在雄性羅氏沼蝦不同組織中的相對表達量排序為肝胰腺>胃>腹部神經(jīng)>腸道>精巢>心臟>肌肉>鰓組織，在雌性羅氏沼蝦中則表現(xiàn)為肝胰腺>胃>腸道>卵巢>腹神經(jīng)節(jié)>心臟>鰓組織>肌肉，與唐小紅等（2015）、栗志民等（2017）、楊其彬等（2017）的研究結果相似。羅氏沼蝦AMY基因表達的性別差異性和組織特異性，與胰蛋白酶原基因（TRY）在黃羽肉雞中的表達規(guī)律類似，TRY基因在雄性黃羽肉雞肺臟中的相對表達量顯著高于雌性黃羽肉雞，而在肌肉中的相對表達量顯著低于雌性黃羽肉雞（許麗惠等，2018）。

本研究結果顯示，羅氏沼蝦AMY基因在生長快速家系個體肌肉中的相對表達量極顯著高于生長慢速家系個體，與斑節(jié)對蝦AMY基因的整個生長階段均有表達，且在幼體發(fā)育過程中糠蝦期的表達量達峰值（楊其彬等，2017），文蛤AMY基因在不同發(fā)育時期的殼頂幼蟲期表達量最高（高曉艷，2015），以及草魚出膜72 h后AMY基因表達量明顯升高（唐小紅等，2015）的研究結果相似。此外，AMY基因與甲殼類動物的生長性狀顯著相關（Prudence et al.，2006;Huvet et al.，2008;栗志民等，2017）。綜合前人的相關研究結果可知，AMY基因在羅氏沼蝦的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，AMY基因表達量高的生長快速家系個體，其AMY活性相應也較高，因而生長速率快，與在中華絨螯蟹（田華梅等，2003）、華貴櫛孔扇貝（鄧岳文等，2008）、美洲龍蝦（Perera et al.，2008）及馬氏珠母貝（王慶恒等，2010）中研究發(fā)現(xiàn)AMY活性與生長速率緊密相關的結論相似，進一步提示AMY基因可能介導羅氏沼蝦的生長發(fā)育。

4 結論

AMY基因在羅氏沼蝦的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，廣泛表達于羅氏沼蝦的不同組織中，但存在性別差異性和組織特異性。

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（責任編輯 蘭宗寶）