吳 菁 蔣志勇 李奎生 劉 芳 呂志武 * 黃明沂 肖 瑤

（1 深圳市寶安區(qū)福永人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 深圳 518103；2 武漢大學(xué)中南醫(yī)院影像科，湖北 武漢 430071；3 南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳寶安醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 深圳 518101）

食管癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來(lái)食管癌的診斷和治療得到不斷發(fā)展，但患者預(yù)后并不理想，中晚期食管癌患者的5年生存率低于20%[1-2]。食管癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程伴隨多種分子及信號(hào)通路的協(xié)同作用[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（longchain non-coding RNA，lncRNA）是一種轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的內(nèi)源性RNA分子，通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)影響細(xì)胞增殖、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)降解等病理過(guò)程[4-5]。有研究表明，lncRNA在食管癌、鼻咽癌、淋巴癌等多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中起重要作用[6-7]。本研究旨在研究AL158206.1在食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)，觀察上調(diào)AL158206.1對(duì)食管癌細(xì)胞增殖及遷移的影響，探討AL158206.1是否通過(guò)調(diào)控miR-340-5p/ARL4C軸發(fā)揮其作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 人食管上皮細(xì)胞（HET-1A）和食管癌細(xì)胞系（Eca109、KYSE30、TE-13、EC9706）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。NC質(zhì)粒和AL158206.1質(zhì)粒購(gòu)自北京合生基因科技有限公司。RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司。胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司。Lipofectamine 3000試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。MTT試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技公司。一抗和二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 食管癌細(xì)胞系和食管上皮細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是37 ℃、5%CO2、飽和濕度。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KYSE30細(xì)胞接種至6孔板，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，嚴(yán)格按照Lipofectamine 3000試劑說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，分別轉(zhuǎn)染AL158206.1質(zhì)粒（AL158206.1組）和NC質(zhì)粒（NC組），轉(zhuǎn)染12 h后更換培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)AL158206.1、miR-340-5p和ARL4C mRNA表達(dá)水平TRIzol試劑提取食管癌細(xì)胞系和人食管上皮細(xì)胞系總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后在PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)AL158206.1、miR-340-5p和ARL4C mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，U6和GAPDH分別為內(nèi)參。相應(yīng)引物序列如下，U6上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；miR-340-5p上游引物為5'-GCTTATAAAGCAATGAGACTGATT-3'，下游引物為5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；GAPDH上游引物為5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3'，下游引物為5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'；AL158206.1上游引物為5'-TGGTCAGAATTTGCCCAAG-3'，下游引物為5'-TGAAATGATCACTCGGAAACA-3'；ARL4C上游引物為5-CCAGTCCCTGCATATCGTCAT-3'，下游引物為5'-TTCACGAACTCGTTGAACTTGA-3'。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算AL158206.1、miR-340-5p和ARL4C mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖能力 將成功轉(zhuǎn)染的AL158206.1組和NC組KYSE30細(xì)胞經(jīng)胰酶消化為游離細(xì)胞，重新接種于96孔板，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用MTT試劑盒連續(xù)5 d檢測(cè)細(xì)胞的增殖水平，每孔加入20 μL MTT試劑，培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后棄上清，每孔加入130 μL二甲基亞砜，搖床振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)450 nm處的光密度（optical density，OD）值。

1.5 Transwell試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移能力將成功轉(zhuǎn)染的AL158206.1組和NC組KYSE30細(xì)胞經(jīng)胰酶消化為游離細(xì)胞，采用無(wú)胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸后接種于Transwell上室，將含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，將Transwell上室放入甲醇中固定40 min，放入結(jié)晶紫溶液中染色40 min，棉簽擦拭Transwell上室上側(cè)，放入倒置顯微鏡拍照并計(jì)數(shù)。

1.6 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)AL158206.1的靶基因 采用LncBase Predicted v.2數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)AL158206.1的靶向miRNA，采用miRWalk 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miRNA的靶向基因。

1.7 Western blot試驗(yàn)檢測(cè)ARL4C蛋白表達(dá) 提取各組KYSE30細(xì)胞，加入含1%苯甲基磺酰氟的細(xì)胞裂解液，冰上裂解40 min，采用BCA法檢測(cè)各組KYSE30細(xì)胞的蛋白含量，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶在室溫下進(jìn)行封閉，加入一抗ARL4C（1∶1 000稀釋）、CDK2（1∶1 000稀釋）、Cyclin E（1∶3 000稀釋）、IRSp53（1∶2 000）、β-Tubulin（1∶3 000）及MMP-1（1∶1 000），在4 ℃孵育過(guò)夜。使用羊抗兔的二抗（1∶2 000稀釋）孵育50 min。使用ECL發(fā)光試劑進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，以β-Tubulin為內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AL158206.1在食管癌細(xì)胞系中的表達(dá) qRT-PCR試驗(yàn)結(jié)果顯示，與人食管上皮細(xì)胞相比，AL158206.1在食管癌細(xì)胞系（Eca109、KYSE30、TE-13、EC9706）中的表達(dá)明顯減少（P＜0.05），KYSE30細(xì)胞中的表達(dá)最低（P＜0.01）。見圖1。

圖1 AL158206.1在人食管上皮細(xì)胞和食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)

2.2 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對(duì)KYSE30細(xì)胞中AL158206.1表達(dá)的影響 qRTPCR試驗(yàn)結(jié)果顯示，NC組和AL158206.1組KYSE30細(xì)胞中AL158206.1表達(dá)水平分別為（1.04±0.15）和（12.56±0.93）。與NC組相比，AL158206.1組KYSE30細(xì)胞中AL158206.1的表達(dá)明顯增加（P＜0.01）。

2.3 上調(diào)AL158206.1對(duì)KYSE30細(xì)胞增殖能力的影響 MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，第2、3、4、5天，上調(diào)AL158206.1后，KYSE30細(xì)胞增殖能力明顯降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 上調(diào)AL158206.1對(duì)KYSE30細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 上調(diào)AL158206.1對(duì)KYSE30細(xì)胞遷移能力的影響 Transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示，NC組和AL158206.1組KYSE30細(xì)胞的遷移數(shù)分別為（170.60±22.74）個(gè)和（77.84±12.64）個(gè)，AL158206.1組細(xì)胞的遷移數(shù)明顯低于NC組（P＜0.05），表明上調(diào)AL158206.1可抑制KYSE30細(xì)胞的遷移能力。見圖3。

圖3 上調(diào)AL158206.1對(duì)KYSE30細(xì)胞遷移能力的影響

2.5 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)AL158206.1的靶基因AACAGAAAUAAAUUAUUUAUAC 采用LncBase Predicted v.2數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示，AL158206.1的靶基因是miR-340-5p；采用miRWalk 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示，miR-340-5p的靶基因是ARL4C。見圖4。

圖4 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)AL158206.1的靶基因

2.6 上調(diào)AL158206.1對(duì)KYSE30細(xì)胞中miR-340-5p和ARL4C mRNA表達(dá)水平的影響 qRT-PCR試驗(yàn)結(jié)果顯示，NC組和AL158206.1組KYSE30細(xì)胞中miR-340-5p表達(dá)水平分別為（1.19±0.23）和（0.13±0.06），AL158206.1組miR-340-5p的表達(dá)明顯低于NC組（P＜0.01）。NC組和AL158206.1組KYSE30細(xì)胞中ARL4C mRNA表達(dá)水平分別為（1.01±0.09）和（7.23±0.78），AL158206.1組ARL4C mRNA的表達(dá)明顯高于NC組（P＜0.01），表明上調(diào)AL158206.1可抑制miR-340-5p的表達(dá)，促進(jìn)ARL4C mRNA的表達(dá)。

2.7 上調(diào)AL158206.1對(duì)ARL4C蛋白和增殖及遷移有關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blotting試驗(yàn)結(jié)果顯示，上調(diào)AL158206.1后，ARL4C蛋白表達(dá)水平增加，細(xì)胞增殖有關(guān)蛋白如CDK2、Cyclin E表達(dá)水平減少，細(xì)胞遷移有關(guān)蛋白如IRSp53、MMP-1表達(dá)水平減少。見圖5。

圖5 上調(diào)AL158206.1對(duì)KYSE30細(xì)胞ARL4C和增殖及遷移有關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

lncRNA雖然不具有蛋白質(zhì)編碼的功能，但其可在基因染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾等過(guò)程中發(fā)揮作用[8-9]。在包括腫瘤在內(nèi)的各種疾病中均存在lncRNA的異常表達(dá)，lncRNA可直接或間接參與調(diào)控各種信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，作為癌基因或抑癌基因影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[10-11]。Fang等[12]研究表明，LINC01535在食管癌組織和細(xì)胞中表達(dá)明顯高于癌旁組織和食管黏膜上皮細(xì)胞，敲除LINC01535會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)JAK/STAT3信號(hào)通路降低食管癌細(xì)胞增殖能力，增加細(xì)胞的凋亡率。Qiu等[13]研究顯示，PSMA3-AS1在食管癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，PSMA3-AS1表達(dá)與食管癌患者腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)，PSMA3-AS1過(guò)表達(dá)促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲和體外遷移。AL158206.1在腫瘤特別是食管癌細(xì)胞中的表達(dá)和作用尚不清楚。本研究中，AL158206.1的表達(dá)在食管癌細(xì)胞系中明顯增加，提示AL158206.1參與了食管癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程。在食管癌KYSE30細(xì)胞中上調(diào)AL158206.1后，KYSE30細(xì)胞的增殖及遷移能力明顯降低，AL158206.1在食管癌中發(fā)揮抑癌基因功能。

lncRNA可通過(guò)應(yīng)答元件競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合具有相同應(yīng)答元件的miRNA，從而抑制miRNA對(duì)靶基因的干擾作用，間接促進(jìn)miRNA靶基因的表達(dá)[14-15]。本研究中生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，AL158206.1可靶向miR-340-5p，miR-340-5p可靶向ADP-核糖基化樣因子4C（ARL4C）mRNA。有研究顯示，miR-340-5p在食管癌組織中高表達(dá)，降低食管癌細(xì)胞的放療敏感性，發(fā)揮致癌基因功能[16]。本研究中，上調(diào)AL158206.1后，miR-340-5p的表達(dá)明顯減少。ARL4C蛋白由192個(gè)氨基酸組成，屬于ADP-核糖基化樣因子亞家族成員，參與細(xì)胞內(nèi)的囊泡運(yùn)輸[17]。ARL4C可通過(guò)調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞的骨架重構(gòu)，影響上皮細(xì)胞和遷移[18]。上調(diào)ARL4C可抑制卵巢癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移或侵襲，且ARL4C表達(dá)水平較低的腫瘤患者預(yù)后較差[19-20]。qRT-PCR和Western blot試驗(yàn)結(jié)果顯示，AL158206.1抑制miR-340-5p表達(dá)后，miR-340-5p靶基因ARL4C的表達(dá)明顯增強(qiáng)。本研究中，KYSE30細(xì)胞中ARL4C蛋白表達(dá)增強(qiáng)后，細(xì)胞增殖有關(guān)蛋白如CDK2、Cyclin E表達(dá)水平減少，細(xì)胞遷移有關(guān)蛋白如IRSp53、MMP-1表達(dá)水平減少，表明KYSE30細(xì)胞的增殖及遷移能力降低。

綜上所述，AL158206.1在食管癌細(xì)胞系中低表達(dá)，上調(diào)AL158206.1可能是通過(guò)調(diào)控miR-340-5p/ARL4C軸的表達(dá)，抑制食管癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。AL158206.1可能為食管癌的生物靶向治療提供新的候選靶點(diǎn)。