摘要：為了明晰浙江蠟梅葉片的活性成分，進一步挖掘其生物活性，以其葉片為材料，采用不同溶劑提取其活性成分，并進行成分的系統(tǒng)定性、定量（多糖、多酚、黃酮）和抗氧化活性研究。結(jié)果表明，浙江蠟梅葉片活性成分類別豐富，含有酚類、多糖、黃酮、生物堿等多種成分。定量結(jié)果表明，不同提取物間多糖、多酚、黃酮含量差異顯著，其中甲醇提取物中多糖、多酚、黃酮含量均最高，分別為41.82、23.25、18.40 mg/g?？寡趸钚越Y(jié)果表明，不同提取物均具有良好的抗氧化活性，其中甲醇提取物在清除DPPH自由基、還原力方面的能力均最強，其IC50值分別為25.02 μg/mL、0.24 mg/mL。綜合分析可知，浙江蠟梅葉片含有多種活性成分并具有抗氧化活性，是良好的藥用植物。

關(guān)鍵詞：浙江蠟梅;活性成分;定性;定量;抗氧化活性

中圖分類號： R284.1? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）15-0159-04

收稿日期：2021-03-17

基金項目：福建省自然科學基金（編號：2016J05041）;福建省教育廳中青年教師教育專項科研項目（編號：JAT160526、JA15544）。

作者簡介：陳建煙（1986—），女，福建仙游人，博士，講師，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)利用方面的工作。Tel：（0593）2955055;E-mail：jieandyanheart@126.com。

浙江蠟梅（Chimonanthus zhejiangensis M.C.Liu）為蠟梅科（Calycanthaceae）蠟梅屬（Chimonanthus Lindl.）植物，主要分布于浙江南部及福建北部等地，具有優(yōu)良的藥用價值，是重要畬藥食涼茶的來源植物之一[1-3]。畬藥食涼茶采用浙江蠟梅、柳葉蠟梅（C. salicifolius S.Y.Hu）的葉片及嫩芽制作而成，常用于治療感冒、消化不良、小兒疳積、腹瀉、醒酒、解暑、傷食所致的痞滿證和慢性胃炎及十二指腸潰瘍引起的胃脹、胃痛、泛酸等，其用藥歷史悠久、療效確切、副作用少，是應(yīng)用最廣的畬藥之一[4-6]，畬民也常作茶水飲用。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，畬藥食涼茶還具有解熱鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)咳、增強免疫、減肥及降血壓等功效[7-8]。食涼茶的藥效與其所含成分密切相關(guān)，但目前關(guān)于其活性成分及藥效的研究多集中在柳葉蠟梅上，而少見關(guān)于浙江蠟梅的研究。已有研究發(fā)現(xiàn)，柳葉蠟梅含有揮發(fā)油、酚類、黃酮類、香豆素類、蛋白質(zhì)及氨基酸、脂肪、纖維、可溶性糖、維生素等成分[9-12]，而目前對浙江蠟梅活性成分的研究多集中于揮發(fā)油和黃酮類化合物上[1-2，13]，缺乏對其他成分的系統(tǒng)定性分析及對其多酚、多糖、黃酮等活性成分的定量分析。

目前針對浙江蠟梅生物活性的研究極少，只有少量研究發(fā)現(xiàn)，其葉片揮發(fā)油及水提取物具有抗菌活性，其花提取物具有抗氧化活性[13-15]，但目前關(guān)于其葉片抗氧化活性的研究還未見報道。浙江蠟梅以葉片入藥，葉片是其重要的藥用部位。因此，本研究采用不同極性溶劑對浙江蠟梅葉片成分進行提取，并對不同提取物進行成分系統(tǒng)定性、定量和抗氧化活性分析，旨在探明浙江蠟梅葉片的活性成分，進一步挖掘其生物活性，從而為浙江蠟梅的功效拓展及深度開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

本試驗于2017年1—3月在寧德師范學院生物實驗中心進行。試驗材料為浙江蠟梅葉片，于2017年1月采自福建省寧德市壽寧縣，經(jīng)寧德師范學院陳勇教授、劉凱良講師共同鑒定為浙江蠟梅。挑選無病新鮮葉片，洗凈后凍干粉碎，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗試劑：三氯化鐵、鹽酸、硅鎢酸、氫氧化鈉、Tollens 試劑、冰醋酸、濃硫酸、茚三酮、溴酚藍、甲醇、乙酸乙酯、石油醚（60～90 ℃）、葡萄糖、福林酚、沒食子酸、蕓香苷、抗壞血酸（維生素C）、鐵氰化鉀、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（2，2-dipheny-1-picryl hydrazyl，簡稱DPPH，Simga-Aldrich公司），除DPPH外其他試劑均為國產(chǎn)分析純，試驗用水均為超純水。

試驗儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA公司，N-1100D-W）、超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司，scientz-ⅡD）、電子天平（賽多利斯公司，SQP）、恒溫水浴鍋（上海江星儀器有限公司，HH-2）、分光光度計（日本島津公司，UV2550）、冷凍干燥機（日本EYELA公司，F(xiàn)DU-2011）、中草藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司，F(xiàn)W177）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同提取物的制備 精確稱取處理好的浙江蠟梅葉片干粉各50 g于樣品瓶中，分別加入500 mL超純水、95%甲醇、乙酸乙酯、石油醚，于搖床振蕩提取24 h（30 ℃、120 r/min），再超聲提取2 h（300 W、30 ℃），過濾除去濾渣，即得不同提取液。將提取液干燥后磨成粉，即得不同提取物，按下式計算提取物得率：

提取物得率=提取物質(zhì)量（g）浙江蠟梅葉片干粉質(zhì)量（g）×100%。

1.2.2 浙江蠟梅葉片成分的系統(tǒng)定性分析 參考展銳的方法[16]，采用化學預試法對不同提取物進行成分的系統(tǒng)定性分析。

1.2.3 浙江蠟梅葉片成分的定量分析 根據(jù)定性分析結(jié)果，對不同提取物進行多糖、多酚及黃酮化合物的定量分析，其中多糖含量采用苯酚-硫酸法[17]測定，多酚含量參照GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[18]測定，黃酮含量采用Al（NO3）3-NaNO2比色法[19]測定。

1.2.4 浙江蠟梅葉片抗氧化活性的測定 采用清除DPPH自由基和還原力的方法[20]測定不同提取物的抗氧化活性并計算IC50值（清除率/吸光度=50%/0.5時的樣品濃度），以抗壞血酸為陽性對照。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 每組試驗重復3次，結(jié)果表示為“均值±標準差”，試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取物的提取得率

由表1可以看出，采用不同溶劑對浙江蠟梅葉片進行成分提取，各提取物得率間差異顯著，其中甲醇的得率最高，為27.20%，提取得率最低的為石油醚，為2.95%。這可能是由于浙江蠟梅中不同成分的含量不同，而不同極性的溶劑能夠提取的成分類別及含量不同，因此提取得率間差異顯著。

2.2 浙江蠟梅葉片成分定性與定量結(jié)果分析

2.2.1 成分系統(tǒng)定性分析 對不同提取物進行成

分的系統(tǒng)定性分析，結(jié)果（表2）表明，在鑒識的13種成分類別中，浙江蠟梅葉片含有12種，其中甲醇、水、乙酸乙酯和石油醚提取物分別檢出8、8、7、7種成分，且甲醇與水提取物、乙酸乙酯與石油醚提取物兩兩所含成分較為相似。這可能是因為其兩兩溶劑極性較為相近，因此能夠溶解提取的物質(zhì)較為相似。在試驗濃度下，4種提取物中均檢出了酚類、糖/多糖及其苷類、揮發(fā)油及油脂類和有機酸4類成分，而均未檢出氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)類。同類別成分可能因為含有多種化合物而具有不同溶解性，因此可以溶解于不同溶劑中而被檢出。由于本試驗采用化學預試法，檢測結(jié)果可能由于靈敏度不夠高及提取物本身的顏色干擾而導致一些含量較低的成分未能被精確檢出[19]。成分定性結(jié)果表明，浙江蠟梅葉片活性成分類別豐富，值得深入研究。

2.2.2 成分定量分析 對不同提取物中多糖、多酚、黃酮類化合物總含量進行測定，結(jié)果（表3）表明，不同提取物中同類成分的含量差異顯著，甲醇提取物中多糖、多酚、黃酮3種成分含量均最高，分別為41.82、23.25、18.40 mg/g，而石油醚提取物中多糖、多酚、黃酮3種成分含量均最低，分別為5.59、3.06、9.62 mg/g。在甲醇提取物中，這3類成分的含量最高，可能由于浙江蠟梅葉片中這幾類化合物的極性較大，因此更易在甲醇中溶解浸出。多糖、多酚和黃酮是重要的植物活性成分，在浙江蠟梅葉片中，這幾類活性成分的含量較高，揭示其可能具有豐富的生物活性，值得深入挖掘。

2.3 浙江蠟梅不同提取物性能分析

2.3.1 不同提取物對DPPH自由基的清除率 由圖1可以看出，不同提取物對DPPH自由基都具有很強的清除能力，且清除率隨著濃度升高而升高，在本試驗中的最高濃度條件下，甲醇提取物（0.1 mg/mL）、水提取物（0.2 mg/mL）、乙酸乙酯提取物（0.2 mg/mL）、石油醚提取物（4.0 mg/mL）的清除率分別為85.67%、91.19%、90.67%、90.77%?？傮w上看，石油醚提取物清除DPPH自由基的效果弱于其他三者，而所有提取物的效果都稍弱于陽性對照抗壞血酸。植物多糖、多酚及黃酮類成分通常具有很強的抗氧化活性，在石油醚提取物中這3種成分含量較低，可能是由于其對DPPH自由基的清除能力弱于其他提取物。

2.3.2 不同提取物的還原力 由圖2可以看出，甲醇提取物、水提取物和乙酸乙酯提取物具有較強的還原力，其還原力隨著濃度的上升而急劇升高，石油醚提取物的還原力相對較弱，隨著濃度升高，還原力上升較慢;但幾種提取物的還原力都稍弱于陽性對照抗壞血酸。不同提取物的還原力與其所含成分及成分間的相互作用密切相關(guān)，不同提取物的還原力強弱與其中多糖、多酚和黃酮含量高低結(jié)果相符，說明這幾種成分可能是其還原力的重要組成成分。

2.3.3 不同提取物的IC50值 由表4可以看出，在清除DPPH自由基方面，甲醇提取物（25.02 μg/mL）和水提取物（45.20 μg/mL）效果優(yōu)越，其IC50值雖然高于抗壞血酸，但三者之間的差異不顯著;而石油醚提取物的IC50值最高，其清除DPPH自由基的能力最弱。在還原力方面，不同提取物的效果差異顯著，甲醇（0.24 mg/mL）的效果最優(yōu)，石油醚（2.36 mg/mL）的效果最差，但它們的IC50值均顯著高于陽性對照抗壞血酸，說明不同提取物雖然還原力較強但仍然低于抗壞血酸。綜合比較發(fā)現(xiàn)，浙江蠟梅葉片提取物具有較好的抗氧化能力，但其清除DPPH自由基的能力優(yōu)于還原力。

3 結(jié)論與討論

采用甲醇、水、乙酸乙酯、石油醚4種溶劑提取浙江蠟梅葉片的活性成分，并進行系統(tǒng)定性、定量分析。結(jié)果顯示，浙江臘梅葉片所含成分類別豐富，在所檢測的13種成分中，除氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)類外，浙江蠟梅葉片含有包括酚類、糖類、黃酮類、香豆素類、生物堿、皂苷、揮發(fā)油及油脂類等在內(nèi)的12種成分，其在成分類別上與同藥源植物柳葉蠟梅相似[21]。本研究未檢測浙江蠟梅葉片中的脂肪、維生素及礦質(zhì)元素等成分，留待后續(xù)研究。柳葉蠟梅葉片含有氨基酸及蛋白質(zhì)類，這與本研究結(jié)果有差異，可能是由于檢測溶液濃度過低或提取、檢測手段差異導致的。在成分定量分析方面，甲醇提取物在多糖、多酚和黃酮類成分含量上均最高，且其提取得率也最高，揭示其可能是提取浙江蠟梅葉片活性成分的優(yōu)良溶劑。本研究僅對多糖、多酚和黃酮總含量進行測定，后續(xù)可對每種成分類別中的具體化合物進行分離測定，明確每種成分類別的構(gòu)成及含量，以進一步比較不同溶劑提取效果的優(yōu)劣。與柳葉蠟梅相比，浙江蠟梅葉片中的黃酮含量更高，但多酚含量更低[12，22-23]，這種差異除了由于植物特性上的差異外，還可能與提取溶劑、方法等不同有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，浙江蠟梅葉片具有良好的抗氧化活性，其甲醇提取物在清除DPPH自由基和還原力方面均較其他提取物優(yōu)越，其IC50值分別為25.02 μg/mL、0.24 mg/mL。除了石油醚提取物外，浙江蠟梅葉片其他3種提取物在清除DPPH自由基方面優(yōu)于柳葉蠟梅;但在還原力方面，除了甲醇提取物外，浙江蠟梅葉片其他3種提取物均弱于柳葉蠟梅[12，23]。由此可見，在抗氧化活性方面柳葉蠟梅與浙江蠟梅各有優(yōu)劣，這可能與兩者所含抗氧化成分（如多酚、黃酮等）類別、含量不同有關(guān)。浙江蠟梅葉片提取物具有良好的抗氧化活性，但具體是哪些成分類別、同一類別中的哪些化合物及其結(jié)構(gòu)、含量等發(fā)揮作用還未可知，其機制有待進一步研究明確。除了抗氧化活性外，已有研究發(fā)現(xiàn)，柳葉蠟梅還具有抗癌、抑菌、肝損傷保護等作用[11-12，24-25]，但關(guān)于浙江蠟梅生物活性方面的研究還較少。綜合比較兩者成分類別相似，浙江蠟梅可能也具有上述生物活性，今后可進行相關(guān)方面的研究。

綜上所述，浙江蠟梅葉片含有多種活性成分，具有良好的抗氧化活性，是一種極具開發(fā)潛能的植物材料，并可能具有其他多種重要的生物活性，具體有待深入研究，具有廣闊的研究應(yīng)用空間。

參考文獻：

[1]歐陽婷，麥 曦.? 浙江蠟梅葉揮發(fā)油化學成分GC-MS分析[J]. 中藥材，2010，33（3）：385-387.

[2]吳 敏，陳紅梅，干紅女，等. HPLC同時測定浙江蠟梅中3種黃酮類成分的含量[J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學，2015，32（7）：863-866.

[3]Ma S J，Lv Q D，Zhou H，et al. Identification of traditional She medicine Shi-Liang tea species and closely related species using the ITS2 barcode[J]. Applied Sciences，2017，7（3）：1-12.

[4]胡劍影，李水福. 畬藥食涼茶[J]. 中國藥業(yè)，2009，18（10）：78.

[5]王 麗，鄢連和，楊婷婷，等. HPLC同時測定畬藥食涼茶中蘆丁、槲皮素的含量[J]. 中華中醫(yī)藥學刊，2014，32（12）：2916-2918.

[6]楊成梓，李烈輝，何幫劍，等. 閩東畬藥芝蘭青的GC/MS研究[J]. 中國醫(yī)藥導報，2013，10（7）：126-128.

[7]朱文佩，劉麗華. 淺談畬藥食涼茶[J]. 中國民族民間醫(yī)藥雜志，2011，20（7）：40.

[8]潘 銓，劉忠達，陳禮平，等. 畬藥食涼茶組方結(jié)合西藥治療痰濕壅盛型原發(fā)性高血壓30例[J]. 上海中醫(yī)藥雜志，2012，46（3）：49-50，64.

[9]韋夢鑫，劉智慧，查錢慧，等. 柳葉蠟梅葉揮發(fā)油的提取工藝及對脂自由基的清除作用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2013，41（4）：1724，1747.

[10]Wang X X，Zhang H J，Li D，et al. Coumarin and flavone constituents of Chimonanthus salicifolius with antioxidant activities[J]. Chemistry of Natural Compounds，2019，55（3）：534-537.

[11]Wang N，Chen H，Xiong L，et al. Phytochemical profile of ethanolic extracts of Chimonanthus salicifolius S. Y. Hu. leaves and its antimicrobial and antibiotic-mediating activity[J]. Industrial Crops & Products，2018，125（15）：328-334.

[12]吳永祥，王 祥，江海濤，等. 不同極性柳葉蠟梅葉萃取物總酚含量及其抗氧化、抑菌能力研究[J]. 食品與機械，2017，33（8）：150-154.

[13]Yu C L，Kuang Y，Yang S X，et al. Chemical composition，antifungal activity and toxicity of essential oils from leaves of Chimonanthus praecox and Chimonanthus zhejiangensis[J]. Asian Journal of Chemistry，2014，26（1）：254-256.

[14]Zhang X F，Xu M，Zhang J W，et al. Identification and evaluation of antioxidant components in the flowers of five Chimonanthus species[J]. Industrial Crops & Products，2017，102：164-172.

[15]程東慶，方 浩，潘佩蕾，等. 浙江蠟梅葉提取物抑菌試驗[J]. 實用中醫(yī)藥雜志，2005，21（5）：314.

[16]展 銳. 火絨草有效成分和抗氧化作用的研究[D]. 烏魯木齊：新疆大學，2010.

[17]李永裕. 余甘多糖分離純化、結(jié)構(gòu)及抗氧化活性研究[D]. 福州：福建農(nóng)林大學，2010.

[18]中國國家標準化管理委員會.茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法：GB/T 8313—2008[S]. 北京：中國標準出版，2008.

[19]余雪芳. 千層金葉片抗氧化活性物質(zhì)分離純化及結(jié)構(gòu)分析[D]. 福州：福建農(nóng)林大學，2015.

[20]陳建煙. 花葉艷山姜葉片精油提純、結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性研究[D]. 福州：福建農(nóng)林大學，2014.

[21]胡長玉，唐欣昀. 野生柳葉蠟梅葉營養(yǎng)成分分析[J]. 黃山學院學報，2007，9（3）：91-93.

[22]溫慧萍，肖建中，雷偉敏，等. HPLC結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化柳葉蠟梅總黃酮提取工藝及其抑菌活性研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學報，2018，30（2）：298-306.

[23]郭孝成，王 偉，戴 毅，等. 柳葉蠟梅不同部位提取物總多酚含量及體外抗氧化、抑菌特性比較研究[J]. 黃山學院學報，2018，20（5）：66-70.

[24]張健健，陸天飛，董 彪，等. 柳葉蠟梅提取物對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用[J]. 肝臟，2014，19（2）：112-114.

[25]陳 斐. 柳葉蠟梅提取物抑制HeLa細胞生長及誘導細胞凋亡的研究[D]. 杭州：浙江大學，2010.