馬震卓 郝 鑫 石光耀 張 霖 于淑紅 申國(guó)強(qiáng) 蔡成坤 張 新

對(duì)骨折愈合的研究隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)從細(xì)胞生物學(xué)水平深化到分子生物學(xué)水平［1-3］。研究者［3-6］發(fā)現(xiàn)，在骨折血腫細(xì)胞中存在各種生長(zhǎng)因子，包括血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、轉(zhuǎn) 化 生 長(zhǎng) 因 子?β（transforming growth factor?β，TGF?β）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng) 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）等。盡管各種生長(zhǎng)因子在骨組織及血腫細(xì)胞中含量較少，但在骨折愈合過(guò)程的不同時(shí)期中，對(duì)調(diào)節(jié)骨細(xì)胞分裂、細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞外基質(zhì)合成及組織分化等起著不可替代的作用［7-10］。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取雄性新西蘭大白兔36只（北華大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供），體重2.5~3 kg，兔齡7~8個(gè)月。平均分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組18只動(dòng)物。

2.骨折模型制備和分組處理

用25%烏拉坦麻醉劑對(duì)實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行麻醉，按4 ml/kg經(jīng)耳緣靜脈緩慢推注，麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，對(duì)實(shí)驗(yàn)兔右下肢股骨髁上下5 cm范圍進(jìn)行剪毛處理，局部碘伏消毒3遍，股骨髁上部周圍注射鹽酸利多卡因浸潤(rùn)麻醉，用外骨折器在股骨髁上制作閉合骨折模型［7，11］。骨折兔放置2 h后，無(wú)菌操作，切開(kāi)皮膚肌肉，分組進(jìn)行相應(yīng)處理。

實(shí)驗(yàn)組：快速收集骨折斷端周圍血腫細(xì)胞液，無(wú)菌條件下制備并分離骨折血腫細(xì)胞，對(duì)骨折斷端行鋼針內(nèi)固定。將可吸收性明膠海綿吸附分離后的血腫細(xì)胞液，放置于骨折斷端，使其緩慢釋放。對(duì)照組：按常規(guī)方法去除骨折斷端周圍血腫細(xì)胞液后行鋼針內(nèi)固定。分別于術(shù)后第10、20、30天，每組各隨機(jī)選取6只動(dòng)物處死，取材后進(jìn)行影像學(xué)和組織學(xué)觀察。

3.X線檢查

觀察股骨髁骨折處骨痂形成數(shù)量，骨質(zhì)密度情況。影像學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①0分，骨折斷端邊緣清晰，無(wú)骨膜反應(yīng)；②1分，骨折斷端邊緣較模糊，輕微骨膜反應(yīng)；③2分，骨折邊緣模糊，骨膜反應(yīng)淺、少量骨痂、密度淡；④3分，骨折斷端接近消失，骨膜反應(yīng)深、骨痂增多、密度深；⑤4分，骨折斷端邊緣完全消失，骨膜反應(yīng)近似骨影、骨痂充滿缺損區(qū)、密度與骨皮質(zhì)相同。

4.組織學(xué)觀察

在無(wú)菌條件下取骨，將股骨干周圍軟組織清除干凈，在距股骨髁骨折處兩端1 cm處整齊鋸下標(biāo)本骨，將其放入10%中性甲醛溶液中，固定12 h后用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，再加入10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中脫鈣5周后，經(jīng)脫水-透明-浸蠟-包埋備用。

4.1 HE染色及觀察

制作石蠟切片，以5 mm厚度為標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)脫蠟-水化-蘇木精染色-鹽酸酒精分化-伊紅染色-脫水透明，最后中性樹(shù)膠封片。光鏡下觀察HE染色切片，觀察骨痂生長(zhǎng)的組織形態(tài)，以及HE染色骨組織切片中成骨細(xì)胞的數(shù)量。

4.2 免疫組織化學(xué)染色（SP法）

將標(biāo)本分組，分別滴加蒸餾水稀釋后，加入1︰300的PDGF抗體、TGF?β抗體作為一抗。放置于4℃冰箱過(guò)夜12 h，在標(biāo)本中分別滴加SP（鏈霉親和素?過(guò)氧化物酶），滴加已經(jīng)先配制的二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色溶液顯色，放入蘇木精溶液中復(fù)染。在顯微鏡下鏡檢觀察，同時(shí)記錄數(shù)據(jù)，照相、存盤。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用spss19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，符合正態(tài)分布者采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.一般情況

2組實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后1周進(jìn)食恢復(fù)正常，活動(dòng)恢復(fù)正常，切口無(wú)感染。術(shù)側(cè)肢體可自然活動(dòng)。

2.X線表現(xiàn)

術(shù)后第10天，2組實(shí)驗(yàn)兔均無(wú)明顯骨痂形成，實(shí)驗(yàn)組骨折斷端輕度模糊征象。術(shù)后第20天，對(duì)照組骨折斷端邊緣模糊，多數(shù)均無(wú)明顯骨痂形成；實(shí)驗(yàn)組骨折斷端見(jiàn)有少量骨痂形成，骨痂的密度低于正常的骨質(zhì)的密度。術(shù)后第30天，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組骨折斷端均有骨痂出現(xiàn)，且骨痂密度均高于術(shù)后第20天，實(shí)驗(yàn)組骨痂量明顯高于對(duì)照組，少數(shù)對(duì)照組骨折斷端局部可見(jiàn)低密度骨折線。2組影像學(xué)評(píng)分詳見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組術(shù)后不同時(shí)間影像學(xué)評(píng)分

3.HE染色結(jié)果

實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后不同時(shí)間骨折斷端標(biāo)本HE染色結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)HE染色切片中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果（表2）顯示，術(shù)后第10、20、30天，實(shí)驗(yàn)組中的成骨細(xì)胞數(shù)量均多于對(duì)照組。

表2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組成骨細(xì)胞數(shù)量對(duì)比

圖1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組術(shù)后不同時(shí)間骨折斷端標(biāo)本HE染色結(jié)果

4.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

4.1 PDGF在骨組織中的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后不同時(shí)間骨組織PDGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見(jiàn)圖2。術(shù)后第10天，實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞免疫表達(dá)弱陽(yáng)性；對(duì)照組無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，僅見(jiàn)骨細(xì)胞存在。術(shù)后第20天，實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞免疫表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性；對(duì)照組免疫弱陽(yáng)性表達(dá)。術(shù)后第30天，實(shí)驗(yàn)組骨細(xì)胞免疫表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，與術(shù)后第20天的表達(dá)強(qiáng)度相仿；對(duì)照組弱陽(yáng)性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后不同時(shí)間骨組織PDGF表達(dá)強(qiáng)度詳見(jiàn)表3。

圖2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組骨組織PDGF的表達(dá)（×40）

表3 骨折愈合不同時(shí)間成骨細(xì)胞PDGF的表達(dá)

4.2 TGF-β在骨組織中的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后不同時(shí)間骨組織TGF?β免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見(jiàn)圖3。術(shù)后第10天，實(shí)驗(yàn)組在骨組織骨小梁周圍見(jiàn)少量顏色較淺淡的棕黃色顆粒，為成骨細(xì)胞TGF?β的弱陽(yáng)性表達(dá)；對(duì)照組沒(méi)有陽(yáng)性表達(dá)，僅見(jiàn)骨細(xì)胞存在。術(shù)后第20天，實(shí)驗(yàn)組骨組織骨小梁周圍見(jiàn)密集排列的成骨細(xì)胞，其顏色為深棕黃色顆粒改變，TGF?β呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；對(duì)照組仍沒(méi)有陽(yáng)性表達(dá)。術(shù)后第30天，實(shí)驗(yàn)組骨組織骨小梁周圍成骨細(xì)胞數(shù)量減少，TGF?β表達(dá)強(qiáng)度有所降低，但仍比術(shù)后第10天強(qiáng)；對(duì)照組骨組織周圍見(jiàn)少量淺淡的棕黃色顆粒，呈弱陽(yáng)性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后不同時(shí)間骨組織TGF?β表達(dá)強(qiáng)度詳見(jiàn)表4。

表4 骨折愈合不同時(shí)間成骨細(xì)胞TGF?β的表達(dá)

圖3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組骨組織TGF?β的表達(dá)（×40）

討 論

骨折血腫能夠促進(jìn)骨折愈合已經(jīng)被人們所認(rèn)知，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有大量的實(shí)驗(yàn)及病例報(bào)道［12-15］，骨折血腫在增加骨痂形成數(shù)量、加速骨痂形成、縮短骨折愈合時(shí)間方面有著顯著的促進(jìn)作用［16］。

骨折愈合是復(fù)雜的修復(fù)再生過(guò)程，主要包括早期的損傷反應(yīng)期，中期的膜內(nèi)化成骨期、軟骨形成期和晚期的軟骨內(nèi)化骨。機(jī)體出現(xiàn)骨折后，骨折斷端及周圍軟組織形成血腫，血腫細(xì)胞內(nèi)富含多種生長(zhǎng)因子及大量炎性細(xì)胞，促進(jìn)骨折傷口愈合的同時(shí)清除壞死的炎性組織，為骨折愈合全過(guò)程起到良好的開(kāi)始作用［17-20］。本研究結(jié)果提示，骨折血腫分離細(xì)胞回植后，骨組織表達(dá)的細(xì)胞因子在骨折愈合的不同時(shí)期發(fā)揮著重要作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，骨折血腫分離細(xì)胞回植后，骨折愈合無(wú)明顯感染及排斥反應(yīng)，提示其可促進(jìn)骨折愈合。在HE染色切片任選視野下觀察，可見(jiàn)成骨細(xì)胞規(guī)則排列在骨組織表面，呈棕黃色強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。在骨折愈合不同時(shí)期，成骨細(xì)胞數(shù)量有所不同。X線片骨折斷端骨痂定量分析證實(shí)，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組骨痂形成時(shí)間短，數(shù)量多。通過(guò)測(cè)定骨折愈合不同時(shí)間骨組織PDGF和TGF?β的表達(dá)，證實(shí)促進(jìn)骨折愈合的分子機(jī)制可能部分與其中PDGF及TGF?β的表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。

骨折早期，PDGF表達(dá)逐漸增強(qiáng)，促進(jìn)成骨細(xì)胞DNA合成，加速其復(fù)制潛能，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，以促進(jìn)纖維骨痂的形成。骨折晚期，在骨折斷端骨痂形成較多，骨痂塑形開(kāi)始，骨折處骨細(xì)胞的吸收與破壞是同時(shí)進(jìn)行的，此時(shí)PDGF呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，同樣說(shuō)明其加速骨折愈合，發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)骨折愈合的作用。從分子水平上研究骨折修復(fù)的機(jī)制，已成為骨折愈合修復(fù)的前沿研究方向，將有助于骨折治療研究的開(kāi)展及新策略的制訂，并指導(dǎo)臨床工作中對(duì)骨折后早期血腫處理，最終對(duì)促進(jìn)骨折愈合、防止延遲愈合或不愈合等并發(fā)癥有重要意義。