臧志意， 魏小東

癌癥是目前造成人類死亡的主要原因之一，肺癌在全球癌癥發(fā)病率中占據(jù)首位，并且是癌癥造成死亡的主要原因[1]。肺癌患者中臨床病理類型多為腺癌，以往研究顯示肺癌的發(fā)生發(fā)展受多方面因素影響，而信號通路異常激活、基因位點(diǎn)突變等誘導(dǎo)細(xì)胞的癌變是其中的重要環(huán)節(jié)之一[2]。隨著新輔助治療及手術(shù)方式的發(fā)展，患者預(yù)后不斷得到改善，但仍不理想。高爾基體磷蛋白3(Golgi phosphoprotein 3,GOLPH3)參與維持高爾基體帶狀結(jié)構(gòu)及囊泡運(yùn)輸?shù)?。有研究顯示細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)氖д{(diào)是導(dǎo)致癌癥發(fā)生的機(jī)制之一[3]。以往研究發(fā)現(xiàn)在肺癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤中GOLPH3的過表達(dá)與患者不良預(yù)后有關(guān)[4]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在促進(jìn)血管生成中起著主導(dǎo)作用，血管的供應(yīng)及新血管的生成對于機(jī)體起著至關(guān)重要的穩(wěn)態(tài)作用，因?yàn)檠軐I養(yǎng)物質(zhì)輸送到組織和器官并去除分解代謝產(chǎn)物[5]。然而，不受控制的血管生長會(huì)促進(jìn)許多疾病發(fā)展，在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用[6]。近期臨床研究已經(jīng)證實(shí)抗VEGF的藥物在抗癌免疫中的作用，但在癌癥治療中VEGF靶向單一療法會(huì)產(chǎn)生耐藥性及局限性[7]。本研究通過探討GOLPH3與VEGF在肺腺癌組織中的表達(dá)及對患者預(yù)后的影響，分析肺腺癌生長轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為肺癌的臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集安徽醫(yī)科大學(xué)無錫臨床學(xué)院2015年1月至2017年6月進(jìn)行手術(shù)診治的66例肺腺癌患者的臨床病理資料，其中男35例，女31例；年齡45～87(64.35±9.58)歲；Ⅰ期32例，Ⅱ期14例，Ⅲ期20例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者28例，未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者38例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前未進(jìn)行新輔助治療患者；(2)行肺癌根治術(shù)后病理結(jié)果為肺腺癌的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者于術(shù)后3個(gè)月及圍手術(shù)期死亡；(2)合并其他腫瘤病史。對66例肺腺癌組織及對應(yīng)的30例癌旁組織進(jìn)行相關(guān)蛋白的免疫組化染色。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2病理組織免疫組化染色 蠟塊組織連續(xù)切片(約4 μm)，隨后進(jìn)行烘片、脫蠟、脫水，3%過氧化氫溶液封閉10 min，高壓抗原熱修復(fù)后滴加一抗(GOLPH3和VEGF 1∶100抗體購自Proteintech公司)，4°孵育過夜后滴加二抗常溫孵育30 min，磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗后應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，蒸餾水沖洗后復(fù)染，鹽酸酒精分化，脫水后中性樹脂封片。

1.3顯微鏡結(jié)果判定 GOLPH3及VEGF主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞質(zhì)染色為陽性。所有結(jié)果由2名高年資病理科醫(yī)師于(×400)倍鏡下，隨機(jī)選5個(gè)視野采用半定量積分法判定結(jié)果[8]。評分標(biāo)準(zhǔn)：采用半定量積分法估計(jì)免疫陽性細(xì)胞的數(shù)量及染色程度。首先，對染色強(qiáng)度進(jìn)行評分：無色(0分)、淺黃色(1分)、棕黃色(2分)和深棕色(3分)。其次，對陽性細(xì)胞的百分比進(jìn)行評分：無陽性細(xì)胞(0分)、10%或更少陽性細(xì)胞(1分)、11%～50%陽性細(xì)胞(2分)、51%～75%陽性細(xì)胞(3分)、75%以上陽性細(xì)胞(4分)。陽性細(xì)胞染色率與染色強(qiáng)度得分相乘得到最終得分：0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為中度陽性(++)，7～12分為強(qiáng)陽性(+++)；最終得分<6分的為低表達(dá)，≥6分的為高表達(dá)[9]。

1.4隨訪 隨訪時(shí)間為3～60個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為32個(gè)月。采用門診定期隨訪及電話隨訪，隨訪截止日期為2020年12月。

2 結(jié)果

2.1肺腺癌組織與癌旁組織中GOLPH3和VEGF的表達(dá)情況 GOLPH3及VEGF主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，見圖1。肺腺癌組織中的GOLPH3及VEGF蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。相關(guān)性分析結(jié)果顯示GOLPH3與VEGF表達(dá)水平之間存在正相關(guān)(rs=0.414，P<0.05)。見表2。

?GOLPH3在肺腺癌組織中高表達(dá)；?GOLPH3在肺腺癌組織中低表達(dá)；?GOLPH3在癌旁組織中陰性表達(dá)；?VEGF在肺腺癌組織中高表達(dá)；?VEGF在肺腺癌組織中低表達(dá)；?VEGF在癌旁組織中陰性表達(dá)

表1 肺腺癌組織與癌旁組織中GOLPH3和VEGF的表達(dá)情況[n(%)]

表2 GOLPH3與VEGF在肺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性分析結(jié)果

2.2肺腺癌組織中GOLPH3及VEGF表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 GOLPH3表達(dá)水平與組織分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P<0.05)。VEGF的表達(dá)水平與腫塊直徑、淋巴轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 肺腺癌組織中GOLPH3及VEGF表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

續(xù)表3

2.3影響肺腺癌患者預(yù)后的單因素分析結(jié)果 單因素分析結(jié)果顯示，分化程度、腫塊直徑、TNM分期、GOLPH3及VEGF表達(dá)水平是影響患者預(yù)后的因素(P<0.05)。見表4。Kaplan-Meier分析顯示，GOLPH3高表達(dá)組中位生存期為23個(gè)月，1年、3年及5年生存率分別為75.0%、34.3%及23.5%。見圖2。VEGF高表達(dá)組中位生存期為20個(gè)月，1年、3年及5年生存率分別為67.9%、60.6%及16.4%。見圖3。

表4 影響肺癌患者預(yù)后的單因素分析結(jié)果

圖2 GOLPH3表達(dá)水平對肺腺癌患者預(yù)后的生存曲線圖

圖3 VEGF表達(dá)水平對肺腺癌患者預(yù)后的生存曲線圖

2.4影響肺腺癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析結(jié)果 將單因素分析中P<0.05的變量(分化程度、腫瘤直徑、TNM分期、GOLPH3表達(dá)、VEGF表達(dá))納入Cox回歸模型。結(jié)果顯示，TNM分期(HR=2.110，95%CI：1.048～4.250，P<0.05)、VEGF高表達(dá)(HR=2.136，95%CI：1.039～4.391，P<0.05)及GOLPH3高表達(dá)(HR=2.239，95%CI：1.075～4.661，P<0.05)是影響患者生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表5。

表5 影響肺癌患者預(yù)后生存的多因素Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

3.1GOLPH3基因位于5p13基因組，被證明是在癌癥中激活的靶向基因，在癌癥的發(fā)生發(fā)展中有著多種作用[10]。GOLPH3也是高爾基體的4-磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol-4-phosphate,PI4P)效應(yīng)物，在高爾基體到質(zhì)膜運(yùn)輸中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。基因組的不穩(wěn)定是癌細(xì)胞的一個(gè)特征，可造成腫瘤的異質(zhì)性并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[12]。研究證據(jù)表明GOLPH3是維持基因組穩(wěn)定性所必需的[13-14]。同時(shí)，大量研究表明GOLPH3的致癌活性主要與其激活下游信號哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)(mammalian target of rapamycin，mTOR)，導(dǎo)致mTORC1和mTORC2復(fù)合物的活化增強(qiáng)相關(guān)[4]。在癌癥中GOLPH3會(huì)促進(jìn)高爾基體糖基轉(zhuǎn)移酶的高爾基體內(nèi)運(yùn)輸，改變細(xì)胞間粘附和獲得侵襲/細(xì)胞遷移能力，促進(jìn)癌癥的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移[15]。Wang等[9]發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中，GOLPH3過表達(dá)會(huì)通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)及基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，過表達(dá)患者預(yù)后較差。有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、結(jié)直腸癌、腦腫瘤等中GOLPH3的過表達(dá)預(yù)示著患者預(yù)后較差[16-18]。在本研究中發(fā)現(xiàn)GOLPH3高表達(dá)的患者組織分化程度更低，淋巴轉(zhuǎn)移率更高，分期更晚并且預(yù)后更差，說明在肺腺癌中GOLPH3的表達(dá)可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移。同時(shí)，在多因素分析中顯示GOLPH3的高表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與既往研究結(jié)果一致。

3.2VEGF是一種同型二聚體糖蛋白，分子量約為45 kDa，是血管生成(新血管形成)的關(guān)鍵介質(zhì)[19]。VEGF mRNA在許多腫瘤中過度表達(dá)，并且與腫瘤血管生成、侵襲性、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)[20]。Farhat等[21]發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌中出現(xiàn)VEGF高表達(dá)時(shí)患者的預(yù)后更差。有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、胰腺癌、食管癌等多種癌癥中VEGF的高表達(dá)都預(yù)示著患者預(yù)后不良[22-24]。在本研究中肺腺癌組織中VEGF的高表達(dá)率較癌旁組織有明顯差異。同時(shí)，在研究中發(fā)現(xiàn)VEGF高表達(dá)的患者腫瘤更大，更容易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，分期更晚，多因素分析也提示VEGF的高表達(dá)是肺腺癌患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。提示VEGF的表達(dá)可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，與既往研究一致[20]。

3.3研究表明GOLPH3的致癌活性主要與其激活下游信號mTOR相關(guān)[4]。mTOR是PI3K/AKT/mTOR信號通路中的關(guān)鍵點(diǎn)，與腫瘤的生長和增殖有關(guān)[11]。有研究顯示GOLPH3可通過Akt/mTOR信號通路激活下游信號mTOR[25]。而mTOR的活化可以通過上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1a(hypoxia inducible factor-1a，HIF-1a)的表達(dá)促進(jìn)下游因子VEGF激活，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞遷移生成新血管，增加腫瘤細(xì)胞的血流量[17]。在本研究中發(fā)現(xiàn)GOLPH3的表達(dá)水平與VEGF表達(dá)水平呈正相關(guān)，且VEGF低表達(dá)患者中GOLPH3蛋白表達(dá)水平明顯低于VEGF高表達(dá)患者。因此，在肺腺癌中GOLPH3蛋白可能通過激活A(yù)kt/mTOR信號促進(jìn)VEGF的表達(dá)和血管增殖，造成腫瘤的惡變。內(nèi)在分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，在肺腺癌中GOLPH3與VEGF高表達(dá)可能促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移，并且提示較差的預(yù)后。同時(shí)多因素分析顯示兩者都是影響肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。未來通過研發(fā)針對GOLPH3基因的靶向藥物，可能是抑制腫瘤生長與進(jìn)展的新的治療思路，以期改善患者預(yù)后。