蒙麗斌， 潘洪平

痔瘺洗液由紅花、山銀花、大黃、桃仁、花椒、當(dāng)歸、苦參、虎杖、黃柏、地榆炭、白芷和芒硝(配比為2∶3∶3∶1.5∶1.5∶2∶3∶3∶3∶3∶3∶1.5)共十二味中藥經(jīng)加工制成[1]，處方中的大黃具有利濕退黃、瀉熱通便、解毒消癰之功，為駿猛之品當(dāng)為君藥，與臣藥黃柏、山銀花、苦參、地榆炭、白芷(輔助君藥大黃加強(qiáng)清熱解毒、活血止痛、收斂生肌之功)，佐藥紅花、桃仁、花椒、當(dāng)歸、虎杖(協(xié)助君、臣藥以加強(qiáng)治療作用)，使藥芒硝(引經(jīng)調(diào)和藥)，共奏清熱解毒、活血止痛、收斂生肌之功效。藥理研究表明，痔瘺洗液對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、甲型鏈球菌、乙型鏈球菌等細(xì)菌均有抑制作用[2]。本品臨床主要用于痔瘡術(shù)后坐浴[3]、痔瘺病[4]和肛門水腫[5]等治療。由于大黃素和大黃酚為痔瘺洗液的重要抗菌活性成分，因此，測(cè)定大黃素和大黃酚的含量對(duì)痔瘺洗液的質(zhì)量控制顯得尤為重要。根據(jù)大黃素和大黃酚的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，本研究采用高效液相色譜(high-performance liquid chromatography，HPLC)法同時(shí)測(cè)定痔瘺洗液中大黃素和大黃酚的含量，為建立該制劑的質(zhì)量控制方法和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器與試藥 1200型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；CP225D型電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)；AW-120型電子天平(西班牙COBOS公司)。大黃素、大黃酚對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為110756-200110、110796-200615。規(guī)格：大黃素含量為98.7%，20 mg/支；大黃酚含量為99.2%，20 mg/支)。痔瘺洗液(上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20101214、20100711、20100121，均在藥品有效期內(nèi)完成試驗(yàn))。乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為超純水。

1.2方法

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。柱溫25 ℃。進(jìn)樣量：供試品、對(duì)照品各10 μl。流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水溶液(80∶20，V/V)。檢測(cè)波長(zhǎng)選擇254 nm。流速為0.8 ml/min。

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱取大黃素、大黃酚對(duì)照品適量，加入無(wú)水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)混合溶液制成每1 ml含大黃素10 μg、大黃酚25 μg的混合對(duì)照品溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.2.2.2 供試品溶液的配制 精密量取供試品30 ml，加鹽酸3 ml，加熱回流30 min，立即冷卻，用三氯甲烷提取3次，每次30 ml合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)眉状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，制得供試品溶液。該法制備的供試品溶液所得的峰形、出峰時(shí)間及分離都可達(dá)到較好效果。

1.2.2.3 陰性樣品溶液配制 取不含大黃的陰性樣品，采用供試品溶液制備方法(“1.2.2.2”項(xiàng)下)制備陰性樣品溶液，進(jìn)樣分析。

1.2.2.4 線性關(guān)系考察 分別取“1.2.2.1”項(xiàng)下的大黃素和大黃酚對(duì)照品溶液，加甲醇制成每1 μl含大黃素0.16 μg、大黃酚0.79 μg的混合對(duì)照品溶液，作為系列濃度的對(duì)照品溶液。依次自動(dòng)進(jìn)樣5、10、15、20、25 μl，記錄色譜圖。以對(duì)照品進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。

1.2.2.5 精密度考察 分別精密吸取“1.2.2.1”項(xiàng)下的大黃素和大黃酚混合對(duì)照品溶液10 μl，在相同的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定峰面積的積分值。分別計(jì)算大黃素、大黃酚峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)。

1.2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，于室溫下0、2、4、6、8、12、24 h分別按上述色譜條件測(cè)定，分別測(cè)定大黃素、大黃酚的峰面積積分值，分別計(jì)算大黃素、大黃酚峰面積的RSD。

1.2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)：20100711)共6份，按供試品溶液制備方法平行制備溶液并測(cè)定大黃素、大黃酚的平均含量及其相應(yīng)的RSD。

1.2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品(批號(hào)：20100711)10 ml，分別精密加入一定量的大黃素、大黃酚對(duì)照品，按“1.2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。

1.2.2.9 樣品含量測(cè)定 取3批痔瘺洗液樣品，按“1.2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，計(jì)算樣品的大黃素、大黃酚含量。

2 結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果表明，大黃素和大黃酚，及其與雜質(zhì)峰分離良好，分離度>1.5，所得峰形尖，對(duì)稱，重復(fù)性好，無(wú)拖尾現(xiàn)象，理論塔板數(shù)符合要求，說(shuō)明色譜柱柱效高，同時(shí)無(wú)陰性干擾，出峰時(shí)間亦達(dá)到滿意的效果。結(jié)果提示色譜條件選擇恰當(dāng)，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)良好。見(jiàn)圖1。

?對(duì)照品；?供試品；?陰性樣品(15.728-大黃素；21.171-大黃酚)

2.2線性關(guān)系考察結(jié)果 以對(duì)照品進(jìn)樣量X(μg)(為橫坐標(biāo))，對(duì)峰面積Y(為縱坐標(biāo))進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果表明，各組分在表1濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。見(jiàn)表1。

表1 大黃素和大黃酚的線性與范圍

2.3精密度考察結(jié)果 大黃素、大黃酚峰面積的RSD分別為0.35%、0.12%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 室溫下0～24 h內(nèi)，大黃素、大黃酚的RSD分別為1.52%、0.44%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 同一批樣品的大黃素、大黃酚的平均含量分別為4.83 μg/ml、9.29 μg/ml，RSD分別為0.84%、0.61%(n=6)，表明分析方法重復(fù)性良好。

2.6加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 已知含量的樣品的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果提示，大黃素、大黃酚的平均回收率分別為98.80%、102.50%，RSD分別為0.19%、0.02%。見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.7樣品含量測(cè)定結(jié)果 3批痔瘺洗液樣品的大黃素、大黃酚含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1大黃素與大黃酚具有相似的分子結(jié)構(gòu)，兩者極性相近，傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法可將大黃素與大黃酚混合物(如總蒽醌)的乙醚液，依次用碳酸鈉、氫氧化鈉水溶液萃取，分別得到大黃素、大黃酚；或利用聚酰胺柱層析法，以稀醇至高濃度醇洗脫，依次得到大黃素、大黃酚。但這些方法具有步驟繁瑣、操作復(fù)雜、準(zhǔn)確度差、回收率低、精密度和重復(fù)性不高、分析結(jié)果慢等缺點(diǎn)，均不適宜作為制劑的質(zhì)量控制方法。HPLC法以液體為流動(dòng)相，將不同極性的混合物溶于溶劑中，通過(guò)高壓輸液系統(tǒng)，泵入裝有固定相的色譜柱中，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。HPLC法具有高壓、高速(分析速度快)、高效(分離效能高)、高靈敏度、操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好和應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。已有一些文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)HPLC法同時(shí)測(cè)定大黃素、大黃酚等成分的含量，對(duì)口服中成藥[6-7]、外用中成藥[8-11]、中藥材[12-13]甚至一些民族藥[14]進(jìn)行有效質(zhì)量控制。由于大黃是痔瘺洗液的重要藥味，而大黃素和大黃酚則是大黃的主要有效成分。目前已見(jiàn)一些關(guān)于痔瘺洗液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的報(bào)道：楊家福等[15]采用薄層色譜法鑒別痔瘺洗液中的大黃、黃柏；陳展[16]采用加速試驗(yàn)和長(zhǎng)期試驗(yàn)方法,考察痔瘺洗液在不同試驗(yàn)條件下樣品的性狀、鑒別、含量及微生物的變化,并對(duì)痔瘺洗液進(jìn)行了質(zhì)量穩(wěn)定性考察,以評(píng)價(jià)該藥品質(zhì)量；陳展和凌曉云[17]還建立了痔瘺洗液微生物限度檢查方法；陳展和吳曉燕[18]采用HPLC法對(duì)山銀花中的綠原酸進(jìn)行了含量測(cè)定以建立痔瘺洗液的質(zhì)量控制方法。本研究采用HPLC法同時(shí)測(cè)定痔瘺洗液中主要抗菌活性成分大黃素和大黃酚的含量，具備一定的難度和較好的藥理針對(duì)性，其方法及實(shí)驗(yàn)過(guò)程可重復(fù)性較好，進(jìn)一步拓寬痔瘺洗液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，為建立該制劑精準(zhǔn)的質(zhì)量控制方法和提高質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，具備一定的創(chuàng)新性和指導(dǎo)意義。

3.2從本研究結(jié)果概括出以下幾點(diǎn)體會(huì)。(1)大黃素、大黃酚提取條件的確定。在對(duì)痔瘺洗液中大黃素和大黃酚進(jìn)行提取的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，曾試用5%～30%鹽酸進(jìn)行酸化處理，結(jié)果表明利用10%鹽酸酸化后提取效果最佳。在對(duì)加熱回流時(shí)間(5～60 min)進(jìn)行考察時(shí)確定加熱回流30 min為最佳時(shí)間。在對(duì)甲醇、乙醇、三氯甲烷等溶劑進(jìn)行考察時(shí)，確定三氯甲烷提取3次較為完全且易于揮發(fā)蒸干溶劑。(2)大黃素、大黃酚檢測(cè)波長(zhǎng)的確定。根據(jù)大黃素和大黃酚均具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，以及凡具有芳香環(huán)或共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物在特定吸收波長(zhǎng)處所測(cè)得的吸收度可用于藥品的鑒別、純度檢查及含量測(cè)定的原理[19]，各取大黃素、大黃酚對(duì)照品的甲醇溶液，經(jīng)可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)，在220～470 nm波長(zhǎng)的范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果大黃素和大黃酚的最大吸收波長(zhǎng)分別是253.9 nm和255.1 nm。借鑒其他含大黃成分的中成藥進(jìn)行大黃素和大黃酚含量同時(shí)測(cè)定以監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量的方法[20]，以及筆者對(duì)含大黃成分的中成藥痔瘺洗液樣品的實(shí)際測(cè)定結(jié)果，本研究確定大黃素、大黃酚同時(shí)測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。(3)流動(dòng)相和柱溫的確定。一般用于分離大黃素和大黃酚的流動(dòng)相主要有甲醇-0.1%磷酸水溶液(70∶30)、甲醇-0.1%磷酸水溶液(85∶15)和甲醇-0.1%磷酸水溶液(80∶20)。對(duì)以上的流動(dòng)相，采用柱溫25℃，流速0.8 ml/min，逐一系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%磷酸水溶液(80∶20)為流動(dòng)相時(shí)，對(duì)痔瘺洗液中大黃素、大黃酚及其相鄰峰分離良好，分離度>1.5，同時(shí)所得到的峰形尖，對(duì)稱，重復(fù)性好，不拖尾，理論塔板數(shù)符合要求，柱效高，同時(shí)無(wú)陰性干擾，出峰時(shí)間亦達(dá)到滿意的效果。(4)進(jìn)樣量的考察。分別對(duì)進(jìn)樣量為5 μl、10 μl、20 μl的對(duì)照品和樣品進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在峰的響應(yīng)值滿足的前提下，綜合考慮峰形、峰高、RSD值、雜質(zhì)干擾和色譜柱壽命等情況，決定10 μl為較為理想的進(jìn)樣量。(5)色譜條件的確定。通過(guò)優(yōu)選，本研究確定HPLC法同時(shí)測(cè)定痔瘺洗液中大黃素和大黃酚含量的色譜條件：柱溫25 ℃，流速0.8 ml/min，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液(80∶20)。

總之，利用上述色譜條件以HPLC法同時(shí)測(cè)定痔瘺洗液中的大黃素、大黃酚含量時(shí)，大黃素、大黃酚與其他干擾成分得到較好的分離。該法具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、回收率好、精密度和重復(fù)性高、分析快速等優(yōu)點(diǎn)，可用來(lái)連續(xù)測(cè)定痔瘺洗液中的大黃素、大黃酚含量，同時(shí)該色譜條件下陰性樣品溶液不產(chǎn)生干擾，提示該方法適合作為痔瘺洗液的質(zhì)量控制方法。