王春瓊，陳 丹，蔡潔云，張 軻，李 苓，張 燕，顧健龍，孫浩巍，曾天寶，彭麗娟**

(1. 云南省煙草質量監(jiān)督檢測站，云南 昆明 650106；2. 深圳市一正科技有限公司，廣東 深圳 518101)

采用造紙法工藝并添加多種添加劑制備的加熱不燃燒卷煙專用新型薄片，能夠改變煙草中的化學組分，實現煙草原料有序加工，調控加熱不燃燒卷煙煙氣組分[1-2]. 作為加熱不燃燒卷煙芯基材的專用原料，該新型薄片雖具有諸多優(yōu)點，但在煙葉原料本身及調制加工過程中，紙基中的半纖維素、纖維素和木質素，涂布液中的水溶性糖、果膠和淀粉等前體物質會發(fā)生化學變化，產生大量甲醛，使得加熱不燃燒卷煙在抽吸過程中甲醛的釋放量升高[3-5]. 甲醛是一類重要有害物質，揮發(fā)性強，反應活性大，具有致癌、吸入危險、成癮性，在加熱不燃燒卷煙的抽吸過程中會不同程度地刺激人體的呼吸系統和感覺器官，危害人體健康，已經被世界衛(wèi)生組織確定為致癌和致畸性物質[6]. 因此，對加熱不燃燒卷煙中甲醛的控制，尤其是對其進行有效檢測的技術研究，對保護消費者健康安全、提升加熱不燃燒卷煙質量和煙草企業(yè)的利益均有著重要意義.

目前國外煙草公司對加熱不燃燒卷煙的研究大多集中在煙氣成分、毒理學評價等方面[7-11]，而國內目前研究重點是通過熱重和熱裂解分析等方法對加熱不燃燒卷煙中加熱段煙草基體的熱行為進行研究[12-16]，但對加熱不燃燒卷煙的有害成分及其含量的研究較少，新型薄片中甲醛的測定更是未見任何公開報道. 據調研，只有一家中煙企業(yè)內部標準用高效液相色譜法測定甲醛，但該方法前處理需衍生化，操作繁瑣，且儀器昂貴、檢測成本高、分析周期長，較難普及，也難以滿足大規(guī)模檢測的需要[17-19]. 連續(xù)流動分析儀不僅設備便宜，維護成本低，且具有前處理簡單，上機操作簡便，檢測快速，定量準確等優(yōu)勢[20-21]. 國內煙草行業(yè)自20 世紀80年代引進連續(xù)流動分析儀以來，已進行了煙草及煙草制品中水溶性糖、總植物堿、總氮、總揮發(fā)酸、淀粉、游離態(tài)煙堿等化學成分的檢測，也有采用連續(xù)流動分析儀進行卷煙紙中氯、鉀、硝酸鹽等的檢測[22-23]，但目前還未見有運用連續(xù)流動分析儀檢測新型薄片中甲醛的報道.

鑒于此，本文基于甲醛的醛基與乙酰丙酮在線反應生成420 nm 處有吸收的顯色復合物的原理，建立了測定加熱不燃燒專用新型薄片中甲醛含量的連續(xù)流動-分光光度法，該方法成本低廉、前處理簡單、測定快速、定量準確、檢出限低，非常適合薄片企業(yè)生產質量監(jiān)管的需要.

1 材料和方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料 樣品1#、2#為云南某再造煙葉有限公司產品，樣品3#、4#和5#為云南中煙技術中心加熱不燃燒卷煙芯基材.

1.1.2 試劑 乙酸銨（國藥集團化學試劑有限公司），氨水（國藥集團化學試劑有限公司），乙酰丙酮（汕頭市西隴化工廠），鹽酸（汕頭市西隴化工廠），氫氧化鈉（汕頭市西隴化工廠），37%甲醛（國藥集團化學試劑有限公司）. 以上試劑均為分析純. 活性炭顆粒（中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W試劑公司）. 乙酰丙酮試劑配制：將36.75 g 乙酸銨置于200 mL 去離子水中，待乙酸銨全部溶解后添加1.25 mL 氨水攪勻，再添加0.5 mL 乙酰丙酮，然后用去離子水稀釋定容到250 mL；去離子水試劑配制：在250 mL 去離子水中加入 0.25 mL 的Brij-35，混勻.

1.1.3 儀器 METLER AE200 分析天平（感量：0.000 1 g，瑞士METLER TOLEDO 公司）；BRAN LUEBBE AA3 連續(xù)流動分析儀（德國BRAN LUEBBE 公司）；Agilent1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）JA5002 天平（感量0.01 g，上海天平儀器廠）；HS501 往復振蕩器（上?；茖嶒炂鞑挠邢薰荆?；Millipore AQUELIX5 純水機（美國MERCK Millipore 公司）.

1.2 方法

1.2.1 高效液相色譜（HPLC）法 稱取薄片樣品1.000 0 g，加入7 mL 水浸潤后，再加入55 mL 乙腈，振蕩萃取30 min，取萃取液加衍生化試劑（按體積比1∶4 比例添加）進行衍生，再經0.45 μm 有機相濾膜過濾，按下述色譜條件進行測定.

色譜條件：C18 柱（150 mm×φ4.6 mm，5 μm），流速0.7 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長365 nm，柱溫為30 ℃，流動相A 為乙腈，流動相B 為水，洗脫梯度見表1.

表1 流動相洗脫梯度Tab. 1 Elution gradient of mobile phase

1.2.2 連續(xù)流動-分光光度法 稱取剪碎的薄片樣品0.500 0 g（0.5 cm×0.5 cm），加入0.01 mol/L 的氫氧化鈉溶液50 mL 和1.5 g 活性炭，振蕩1 h，過濾，收集濾液待用. 用連續(xù)流動分析儀進行分析，流路圖見圖1.

圖1 分析流路圖Fig. 1 Flow chart of determination

分析條件為：檢測速度為30 個/h；進樣與清洗時間比為1∶1；基線校正開通；漂移校正開通.

1.2.3 連續(xù)流動-分光光度法數據處理 新型薄片中甲醛質量分數按公式（1）計算：

式中：w為待測薄片中的甲醛質量分數，mg/kg；ρ為樣品溶液所對應的儀器測定甲醛質量濃度，mg/L；V為萃取液體積，mL；m為碎片樣品質量，g.

2 結果與討論

2.1 分析條件優(yōu)化

2.1.1 連續(xù)流動分析儀主要試劑的管路配制

通過比較樣品溶液、乙酰丙酮試劑和去離子水3種試劑的不同管路配置對系列標準工作液的影響選擇適宜的管路配置. 用0.01 mol/L 的NaOH溶液逐級稀釋37%甲醛溶液，依次得到0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L 和1.0 mg/L 的甲醛標準工作液. 如表2 所示，綜合考察峰形、分離度、線性所對應的最高甲醛質量分數、線性相關系數等，選擇如下管路配置：樣品溶液和去離子水均用用紅/紅泵管（流速為0.80 mL/min），乙酰丙酮用黑/黑泵管（流速為0.32 mL/min）.

表2 連續(xù)流動分析儀主要試劑的管路配置Tab. 2 Piping arrangement of main reagents for continuous flow analyzer

2.1.2 顯色反應混合圈匝數的選擇 顯色反應在乙酰丙酮試劑加入后發(fā)生，因此通過改變乙酰丙酮試劑加入后的反應混合圈總匝數對出峰情況的影響以確定顯色反應時間. 如表3 所示，當反應混合圈匝數為5、10 和15 匝時，峰的分離度不好，且線性相關系數較差. 而當反應混合圈匝數為20、25 匝時，峰的分離度都挺好，線性相關系數差異也不大，說明乙酰丙酮試劑加入后，添加20 匝反應混合圈足以完成顯色反應，從縮短檢測時間，提高檢測效率的角度看，選擇20 匝.

表3 顯色反應時間的優(yōu)化Tab. 3 Optimization of color reaction time

2.1.3 分析流路添加透析器的影響 新型薄片樣品溶液偏黃色，而黃色在420 nm 也會有吸收，從而影響420 nm 處的吸光度測定，因此實驗考慮在流路中添加透析器，稀釋樣品溶液，過濾大分子雜質，降低黃色干擾. 表4 為添加透析器前后1#、2#樣品的加標回收率情況，結果表明流路中添加透析器后，樣品與去離子水混合后從透析槽的上部進入，僅有30%的樣品液能通過透析膜，進入透析槽下部流出后與顯色劑反應，可有效地降低黃色樣品溶液對420 nm 處的吸光度造成的假陽性干擾.

表4 流路添加透析器前/后加標回收率的對比（n=5）Tab. 4 Comparison of standard recovery rate before and after adding dialyzer to flow path（n=5）

2.1.4 活性炭用量的影響 專用薄片樣品顏色深，造成樣品溶液背景存在假陽性干擾，需采用活性炭對樣品萃取液進行脫色處理. 取1#樣品0.5 g，按1.2.2 實驗方法進行樣品處理，僅更改活性炭用量，考察其對樣品溶液響應值的影響. 圖2 表明，活性炭用量在1.5 g 以內時，隨著活性炭用量的增加，儀器響應值逐漸降低，大于1.5 g 后響應值趨于穩(wěn)定，故選擇活性炭用量為1.5 g.

圖2 活性炭用量的優(yōu)化Fig. 2 Optimization of activated carbon dosage

2.1.5 振蕩時間的影響 取1#樣品0.5 g，按實驗方法進行樣品處理，僅更改振蕩時間，考察其對樣品溶液響應值的影響. 從圖3 可知，隨著振蕩時間的增加，甲醛不斷被0.01 mol/L 氫氧化鈉溶液溶出，當振蕩時間在1 h 以內時，隨著振蕩時間的增加，響應值逐步升高，大于1 h 后響應值趨于穩(wěn)定，說明薄片中的甲醛被萃取完全，考慮到樣品檢測效率，振蕩時間確定為1 h.

圖3 振蕩時間的優(yōu)化Fig. 3 Optimization of oscillation time

2.1.6 振蕩提取溫度的優(yōu)化 平行稱取1#樣品3 份，進行相同質量濃度加標后，分別在常溫、水浴30 ℃、40 ℃和50 ℃條件下振蕩1 h，其余條件相同，考察加標回收率的情況. 表5 表明，提取條件為常溫時，測定結果最為準確，當溫度超過30 ℃，薄片中的復雜基質溶出，造成測定波長處假陽性干擾，甚至直接超過測定上限，故實驗選擇為常溫振蕩提取.

表5 振蕩提取溫度的優(yōu)化（n=5）Tab. 5 Optimization of oscillating extraction temperature（n=5）

2.1.7 顯色劑加入量的影響 顯色反應是連續(xù)流動法準確定量的關鍵，不同濃度顯色劑對顯色反應的影響也不一致，因此實驗考察了不同濃度顯色劑的乙酰丙酮試劑對甲醛檢測的影響. 固定乙酸銨和氨水的量分別為29.4 g 和1.00 mL，改變乙酰丙酮試劑中乙酰丙酮加入量分別為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，繪制標準曲線，考察出峰時間和線性相關系數. 結果表明，不同條件下出峰時間均為11.5 min，但對線性相關系數影響較大，乙酰丙酮加入量為0.5 mL 時，線性相關系數為0.999 1，其余加入量條件下，線性相關系數略低（圖4）.

圖4 顯色劑加入量的優(yōu)化Fig. 4 Optimization of the dosage of chromogenic agent

2.1.8 乙酸銨-氨水緩沖體系的添加量及其pH

優(yōu)化 實驗依據標準工作曲線的線性相關系數、6次標準溶液（0.4 mg/L）檢測值的RSD，考察了乙酰丙酮試劑中乙酸銨-氨水緩沖體系的添加量及其pH 對檢測的影響. 由表6 可知，添加量2 的乙酰丙酮試劑得到的標準曲線線性相關系數最好，且標準溶液檢測值的RSD 最小，因此確定乙酸銨和氨水的加入量分別為36.75 g 和1.25 mL. 由表7 可知，pH 對顯色反應的影響很大，乙酰丙酮試劑中乙酸銨-氨水緩沖體系為pH=2 時，得到的標準曲線線性相關系數最好. 說明在此條件下，顯色反應效果最佳，其余pH 條件下的線性相關系數，不能達到定量檢測的要求.

表6 緩沖溶液加入量的優(yōu)化Tab. 6 Optimization of buffer solution concentration

表7 緩沖溶液pH 的優(yōu)化Tab. 7 Optimization of buffer solution pH

2.2 方法驗證結果

2.2.1 檢出限和定量限 在最優(yōu)條件下，精確配制得到0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L 和1.0 mg/L 的標準工作液，所得標準工作曲線方程為：y=21.04x+0.13，相關系數r2=0.995 4；采用0.2 mg/L 標準溶液，連續(xù)進樣10 次，測定結果的標準偏差為0.35 mg/kg，因此方法的檢出限為3SD=1.05 mg/kg，定量限為10SD=3.5 mg/kg.

2.2.2 重復性 對5 個專用薄片樣品由同一操作員按照本實驗方法，在同一時段內分別平行測定3 次，結果見表8. 結果表明，本方法測定甲醛質量分 數 的RSD 值 分 別 為0.40%、 0.58%、 0.18%、0.30%和0.53%，均小于1%，重復性較好.

表8 方法重復性Tab. 8 Repeatability of the method

2.2.3 穩(wěn)定性 對5 個專用薄片樣品由同一操作員按照本實驗方法，分別在不同時段內測定3 次，每次平行測定2 次，取平均值，結果見表9. 結果表明，本方法測定甲醛質量分數的RSD 值分別為0.50%、0.67%、0.28%、0.71%和0.32%，均小于1%，穩(wěn)定性較好.

表9 方法穩(wěn)定性Tab. 9 Stability of the method

2.3 樣品檢測結果將5 個薄片樣品用該實驗方法進行甲醛的檢測，并進行加標回收實驗. 結果表明（表10），連續(xù)流動法測定結果的加標回收率為95.5%～110.0%，初步說明測定結果準確、可靠.

表10 樣品測定及加標回收率（n=3）Tab. 10 Results of determination of formaldehyde in samples（n=3）

為進一步驗證連續(xù)流動的測定結果，采用HPLC 法測定5 個薄片樣品中的甲醛，結果見表11.通過T 檢驗比較兩組數據，P＞0.05，說明在95%置信度下，兩種方法測定結果無顯著性差異. 可見，本方法與HPLC 法的一致性較好.

3 結論

隨著加熱不燃燒卷煙風靡市場，薄片企業(yè)生產廠都紛紛增加了新型薄片生產線，各種類型的新型薄片產品問世，國內外市場對薄片安全指標也提出了更高要求. 甲醛沸點低，易揮發(fā)，在加熱不燃燒卷煙抽吸時，對人體的安全隱患不容忽視. 本工作建立的方法具有成本低廉、前處理簡單、測定快速、定量準確、檢出限低等優(yōu)點，具有較高的實用價值，樣品只需加入水和活性炭振蕩提取后過濾，便可直接上機測定，每小時可測30 個樣品，非常適合薄片企業(yè)生產質量監(jiān)管的需要.