王 玨，胡麗麗，李桂蘭，吳 娜，張育敏

(山西中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，晉中 030600)

蒙古黃芪病程相關(guān)蛋白(Astragalusmembranaceuspathogenesis-related protein-10，AmPR-10)是在其遭遇環(huán)境壓力和病原體侵襲時(shí)表達(dá)的一種抵抗外部不利條件的蛋白。天然提取的AmPR-10具有核酸酶活性[1]，且該活性很大程度是與植物防御病原體感染降解RNA類病毒有關(guān)[2]。而無(wú)論是天然黃芪中提取的AmPR-10還是研究中得到的外源重組蛋白，核酸酶活性都比較低[3]。因此進(jìn)一步提高AmPR-10核酸酶活性，探究相關(guān)機(jī)理，對(duì)深入了解黃芪生長(zhǎng)發(fā)育抗病機(jī)制具有重要意義。目前，已知PR-10類蛋白的核酸酶活性可能與一段保守的P-loop環(huán)(GxGGxGxxK)相關(guān)[4]，然而也有很多具有該結(jié)構(gòu)的PR-10類蛋白被證明并沒(méi)有核酸酶活性，這一特征可能不具備必然性[5]。因此需探索可能影響AmPR-10核酸酶活性的新的保守區(qū)及特定氨基酸位點(diǎn)，為目的基因進(jìn)化改造提供參考。

我們對(duì)AmPR-10及其同源蛋白進(jìn)行了序列比對(duì)，并將AmPR-10空腔處(該區(qū)域已被證實(shí)具有配體結(jié)合活性[6])與核苷酸單體進(jìn)行分子對(duì)接,由對(duì)接結(jié)果設(shè)計(jì)氨基酸定點(diǎn)突變，并根據(jù)突變后AmPR-10與配體對(duì)接結(jié)合自由能變化判斷可能對(duì)酶結(jié)合底物有影響的氨基酸位點(diǎn)。首次對(duì)影響AmPR-10核酸酶活性的蛋白保守區(qū)及特定氨基酸做出深入研究，為其他PR類基因外源表達(dá)及活性分析提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種材料

2019年夏季6月采摘蒙古黃芪嫩葉(山西中醫(yī)藥大學(xué)種植)，長(zhǎng)約10 mm，寬約6 mm，將葉片剪碎稱取80 mg左右，用于RNA的提取；感受態(tài)E.coliBL21購(gòu)于生工生物工程(上海)有限公司用于重組子轉(zhuǎn)化。

1.1.2 工具酶及載體

PCR聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I、XhoI、T4DNA快速連接酶購(gòu)于生工生物工程(上海)有限公司；克隆表達(dá)載體pET-30a由山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.3 試劑盒及相關(guān)試劑

細(xì)菌基因組提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠純化試劑盒、Ni2+純化蛋白試劑盒、IPTG、Trizol試劑、酵母tRNA均購(gòu)于生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組子pET30a-AmPR-10的構(gòu)建和表達(dá)

從蒙古黃芪葉片中提取總RNA，通過(guò)RT-PCR進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，擴(kuò)增引物以GenBank 公布的AmPR-10編碼序列為模板進(jìn)行設(shè)計(jì)(Gene ID:ASA69247.1)，上游引物：5′-CGCGAATTCATGGGTGTTA-TAAGTTTCA-3′(劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn))；下游引物：5′-CGCCTCGAGCTTGTATTCAGGATTGGCC-3′(劃線部分為XhoI酶切位點(diǎn))。擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pET30a進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、篩選得到目標(biāo)重組子，經(jīng)測(cè)序確定基因序列正確。隨后使用IPTG誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)條帶。

1.2.2 AmPR-10外源蛋白的純化及核酸酶活性測(cè)定

使用Ni2+純化蛋白試劑盒純化1.2.1表達(dá)的外源蛋白AmPR-10，首先對(duì)IPTG誘導(dǎo)后的重組菌進(jìn)行超聲破碎獲得胞內(nèi)粗蛋白液，然后利用商業(yè)購(gòu)買的Ni-IDA樹(shù)脂，對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行提取純化：將粗蛋白液與緩沖液按1∶1比例混合后過(guò)柱，利用組氨酸標(biāo)簽與樹(shù)脂上Ni+的螯合作用，使AmPR-10吸附于樹(shù)脂柱上，最后通過(guò)洗脫液將目標(biāo)蛋白洗脫，獲得AmPR-10純蛋白(以上實(shí)驗(yàn)過(guò)程需在冰上操作，以保證維持目標(biāo)蛋白活性)。

檢測(cè)純化后AmPR-10的核酸酶活性，測(cè)定方法如下：稱取2 mg酵母tRNA溶于 1 mL緩沖液(100 mmol/L MES，pH 6.0)中，加入100 μL蛋白純化液，50 ℃保溫30 min。反應(yīng)完成后立即加入1 mL預(yù)冷的氯化鋰終止反應(yīng)，冰浴3 h，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清液260 nm 處測(cè)定其吸光度，以未加酶液的樣品為對(duì)照[3]。酶活定義：在50 ℃，pH 6.0反應(yīng)條件，2 mL反應(yīng)體系中，在30 min內(nèi)使A260吸收值變化1.0的酶量定義為一個(gè)活性單位U(參照商品酶Benzonase核酸酶活性定義)，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)純蛋白的濃度，換算得AmPR-10的比活(U/mg)。

1.2.3 AmPR-10同源蛋白序列比對(duì)

(1)通過(guò)Protein BLAST獲得AmPR-10的同源蛋白序列，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，選擇已證實(shí)具有核酸酶活性的蛋白，使用Clustal X軟件進(jìn)行序列比對(duì)，找出AmPR-10在進(jìn)化過(guò)程中的保守區(qū)域。(2)選擇PSIPRED，對(duì)AmPR-10進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，分析(1)中的保守區(qū)域在二級(jí)結(jié)構(gòu)上的分布特征。

1.2.4 AmPR-10與核酸單體分子對(duì)接

對(duì)AmPR-10進(jìn)行SWISS-MODE建模(http://swissmodel.expasy.org/)，獲得PDB文件。利用AutoDock分子對(duì)接軟件將AmPR-10蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與核酸單體小分子(PubChem:6030)進(jìn)行對(duì)接。然后通過(guò)所提供的半經(jīng)驗(yàn)自由能結(jié)果來(lái)評(píng)價(jià)對(duì)接過(guò)程的能量及穩(wěn)定性[7]。根據(jù)野生型AmPR-10與核苷酸單體的對(duì)接結(jié)果，找出配體結(jié)合位點(diǎn)，隨后對(duì)這些點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，并將突變型AmPR-10與核苷酸單體進(jìn)行對(duì)接，通過(guò)比較蛋白突變前后與同一種小分子對(duì)接的自由能變化，分析AmPR-10展現(xiàn)核酸酶活性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，并尋找出可能提高AmPR-10核酸酶活性的突變點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組子pET30a-AmPR-10的表達(dá)及核酸酶活性測(cè)定

蛋白純化結(jié)果(圖1)顯示，AmPR-10由158個(gè)氨基酸組成，蛋白分子質(zhì)量為16.8 ku[8]。外源基因連接在載體pET30a上，其中用于純化的融合標(biāo)簽His-tag為6個(gè)氨基酸。通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)純化后AmPR-10大小，在約17 ku處有目標(biāo)條帶。采用1.2.2所述方法，測(cè)得外源表達(dá)的AmPR-10對(duì)酵母tRNA的水解活性(核酸酶活性)為1.1 U/mg。

2.2 AmPR-10同源序列比對(duì)及結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)NCBI BLAST找到與AmPR-10氨基酸排列順序同源性較高的一系列蛋白，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[9-11]確定每一條同源蛋白是否具有核酸酶活性，篩選出7條同源蛋白信息，具體見(jiàn)表1。

表1 與AmPR-10同源且具有核酸酶活性的病程相關(guān)蛋白Table 1 The proteins with nuclease activity and homologous to AmPR-10

其中基因標(biāo)識(shí)為蛋白在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息識(shí)別序列。將表1中的8條蛋白信息進(jìn)行氨基酸排列順序的同源比對(duì)，具體結(jié)果見(jiàn)圖2。

如圖2所示，比對(duì)結(jié)果分為(a)～(f)6個(gè)部分，以AmPR-10(NCBI ID：ASA69247.1)為研究對(duì)象(圖中紅色標(biāo)注)，該病程相關(guān)蛋白與其他蛋白保守性較高的區(qū)間主要體現(xiàn)在14～24位、44～55位、64～70位、83～88位。在此基礎(chǔ)上，研究對(duì)AmPR-10的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出：14～24位氨基酸位于第一個(gè)α螺旋處，44～55位氨基酸包括2個(gè)連續(xù)的β折疊部分序列及中間的β-轉(zhuǎn)角，P-loop環(huán)則集中在46～51位(GNGGXG)；64～70、83～88位氨基酸分別分布于2個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)上。而較長(zhǎng)的α螺旋由130～153位氨基酸構(gòu)成，保守性不強(qiáng)，相對(duì)靈活。

圖2 AmPR-10同源蛋白氨基酸序列比對(duì)Figure 2 Amino acid sequences alignment of AmPR-10 homologous proteins

圖3 AmPR-10二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果(黃色標(biāo)識(shí)代表β折疊結(jié)構(gòu)，粉色標(biāo)識(shí)代表α螺旋結(jié)構(gòu))Figure 3 The result for the 2D structure of AmPR-10

2.3 AmPR-10與核苷酸單體分子對(duì)接

為進(jìn)一步探討2.2中得到的保守序列氨基酸在AmPR-10水解核酸過(guò)程中的角色及作用，研究將AmPR-10與核苷酸單體進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果如圖4所示。其中圖4(a)表示對(duì)接整體示意圖，核苷酸單體與AmPR-10的空間結(jié)構(gòu)疏水腔進(jìn)行對(duì)接；圖4(b)表示對(duì)接結(jié)果形成氫鍵情況，分別在83位Tyr及140位Gly形成氫鍵(圖中綠色短線標(biāo)識(shí))。

圖4 野生型AmPR-10與核苷酸單體分子對(duì)接結(jié)果Figure 4 Docking results of wild type AmPR-10 with nucleotide monomer

結(jié)合2.2中的分析，83位Tyr是位于AmPR-10第4段保守區(qū)上的氨基酸位點(diǎn)，研究將其分別突變?yōu)槠溆?9種氨基酸，再將突變體蛋白與核苷酸單體分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)蛋白與配體的結(jié)合自由能均增大；而140位氨基酸位于C-末端α螺旋上，該區(qū)域保守性差，同理將140位Gly突變?yōu)槠溆?9種氨基酸，并進(jìn)行突變體蛋白與配體的分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)當(dāng)突變?yōu)锳sn、Trp及Val后，蛋白與配體的結(jié)合自由能會(huì)明顯降低，具體見(jiàn)表2。

表2 AmPR-10野生型及突變型與核苷酸單體對(duì)接結(jié)合自由能結(jié)果Table 2 The results of docking energy for wild type and mutants AmPR-10 with nucleotide monome

3 討論

3.1 AmPR-10 N末端保守α螺旋在三級(jí)結(jié)構(gòu)中的意義

由2.2中的基因序列比對(duì)結(jié)果可知，AmPR-10有4段最明顯的保守區(qū)，集中于前100位氨基酸，而C末端的α螺旋保守性不強(qiáng)，該部分結(jié)構(gòu)猶如手柄狀，對(duì)AmPR-10的空腔形成遮蔽的作用，參與PR-10類蛋白與配體的結(jié)合，進(jìn)而影響目標(biāo)蛋白的生物學(xué)功能[6]，這說(shuō)明若對(duì)AmPR-10核酸酶活性進(jìn)行改造，C端α螺旋的可操作性更強(qiáng)。而從AmPR-10的三級(jí)結(jié)構(gòu)可以看出[圖5(a)]，該區(qū)段與嚴(yán)格保守區(qū)14～24位氨基酸構(gòu)成的第一個(gè)α螺旋在空間上距離很近。因此，研究通過(guò)chimera軟件對(duì)14～24位氨基酸逐一分析后發(fā)現(xiàn)：14位Val與151位Val、152位Leu的距離在空間上<5?[圖5(b)]；19位Leu與144位Phe的距離在空間上<5?[圖5(c)]；22位Ala與147位Leu、151位Val的距離在空間上<5?[圖5(d)]；23位Leu與144位Phe、147位Leu的距離在空間上<5?[圖5(e)]。這些近距離氨基酸全部為疏水性氨基酸，并且均朝向蛋白空腔一側(cè)，這是利于蛋白穩(wěn)定的，因此考慮這些氨基酸可能通過(guò)形成局部的一個(gè)較強(qiáng)疏水區(qū)而有助于維持AmPR-10空腔的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而利于目標(biāo)蛋白的生物學(xué)活性。

圖5 N端α螺旋空間構(gòu)象及特定氨基酸位點(diǎn)分析Figure 5 Analysis of spatial conformation and specific amino acid sites for α-helix in N-terminal

3.2 AmPR-10 特定氨基酸位點(diǎn)對(duì)核酸酶活性的意義

由2.3中的分子對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，參與空腔形成的保守位點(diǎn)83位Tyr突變?yōu)槠溆?9種氨基酸后，結(jié)合自由能均提高，這說(shuō)明蛋白與配體的結(jié)合穩(wěn)定性下降[12]，而空腔結(jié)構(gòu)的輕微改變可能會(huì)致使PR-10蛋白在植物防御過(guò)程中發(fā)揮多種功能[13]，故83位Tyr可能是AmPR-10發(fā)揮核酸酶活性抵御病毒侵襲的重要氨基酸位點(diǎn)，而這也與Tyr本身具有共軛π電子體系，可在分子識(shí)別過(guò)程中起重要作用的觀點(diǎn)相一致[14]；另一個(gè)與核苷酸單體形成氫鍵的氨基酸是位于非保守區(qū)的140位Gly，將其突變?yōu)槠溆?9種氨基酸后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)突變氨基酸是Asn、Val、和Trp時(shí)，目標(biāo)蛋白與配體的結(jié)合自由能明顯下降，表明整體穩(wěn)定性更高，具體如圖6所示。圖6(a)顯示140位氨基酸為Asn時(shí)，配體與Asn形成一條氫鍵；圖6(b)顯示140位氨基酸為Val時(shí)，配體與81位Tyr、23位Leu、140位Val形成3條氫鍵；圖6(c)顯示140位氨基酸為Trp時(shí)，配體與81位Tyr，83位Tyr，27位Ser形成3條氫鍵。這一結(jié)果顯示可能由于單點(diǎn)氨基酸的改變，使得AmPR-10空腔構(gòu)象有不同變化，從而與配體形成不同的結(jié)合方式。

以上分析指出對(duì)提升AmPR-10的核酸酶活性，C末端α螺旋的基因進(jìn)化空間較大，這一結(jié)論也與基因序列比對(duì)結(jié)果相一致：保守區(qū)域氨基酸可能是AmPR-10具有核酸酶活性的關(guān)鍵位點(diǎn)(如83位)，非保守區(qū)域氨基酸靈活性更高，可作為進(jìn)一步提升目標(biāo)蛋白性能的參考位點(diǎn)(如140位)。

(a)140位Gly突變?yōu)锳sn，突變蛋白與核苷酸單體對(duì)接示意圖；(b)140位Gly突變?yōu)閂al，突變蛋白與核苷酸單體對(duì)接示意圖；(c)140位Gly突變?yōu)門rp，突變蛋白與核苷酸單體對(duì)接示意圖 (黃色標(biāo)注為目標(biāo)蛋白與配體分子對(duì)接后，與配體形成氫鍵的氨基酸；綠色標(biāo)注為所形成的氫鍵位置)。圖6 140位氨基酸突變后蛋白分子對(duì)接示意圖 Figure 6 Schematic diagram of protein molecular docking after 140-amino acid mutation

4 結(jié)論

研究檢測(cè)外源表達(dá)的AmPR-10核酸酶活性為1.1 U/mg，考慮通過(guò)基因進(jìn)化進(jìn)一步提高此活性。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)黃芪病程相關(guān)蛋白的活性研究非常少，而核酸酶也因種類較多，蛋白催化機(jī)制沒(méi)有明確統(tǒng)一的解釋[15]?，F(xiàn)已知PR-10蛋白具有兩個(gè)特征：(1)具有P-loop環(huán)結(jié)構(gòu)；(2)具有結(jié)合配體活性的空腔結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，研究通過(guò)對(duì)同源蛋白基因序列比對(duì)及分子對(duì)接試驗(yàn)對(duì)AmPR-10的核酸酶活性機(jī)理進(jìn)行了更為深入的探討。

研究發(fā)現(xiàn)：(1)AmPR-10除了P-loop環(huán)結(jié)構(gòu)以外，還存在3段保守的區(qū)域，并且第一段保守區(qū)N端α螺旋結(jié)構(gòu)與C末端的α螺旋在空間上距離很近，經(jīng)過(guò)氨基酸位點(diǎn)逐一分析，在空間上距離小于5?的氨基酸均是疏水性氨基酸，全部朝向空腔側(cè)，通過(guò)形成較強(qiáng)的疏水區(qū)而穩(wěn)定AmPR-10的空間結(jié)構(gòu)，有利于蛋白在抵抗防御過(guò)程中發(fā)揮作用。(2)通過(guò)分子對(duì)接及氨基酸定點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)位于第4段保守區(qū)域的83位Tyr可能是AmPR-10具有核酸酶活性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，其改變會(huì)引起蛋白與核苷酸單體對(duì)接整體的不穩(wěn)定；而位于保守性較差的C-末端α螺旋上的140位Gly經(jīng)突變?yōu)锳sn、Val和Trp后，分子對(duì)接的結(jié)合自由能下降，因此考慮該區(qū)域結(jié)構(gòu)的氨基酸可作為基因進(jìn)化的參考位點(diǎn)。據(jù)此，研究找出了AmPR-10具有核酸酶活性的獨(dú)立特征、關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)以及可進(jìn)行定向進(jìn)化的可操作區(qū)域，這一結(jié)果為后續(xù)目標(biāo)蛋白活性提升的研究提供理論依據(jù)；另一方面也為類似催化活性機(jī)制不明確的蛋白提供一種新的研究思路和策略。