李加愛，陳麗彬，柳斌彬，趙子瑜，俞烈超，尹孟雄，張 瑩，龔 理

(浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，海洋生物種質(zhì)發(fā)掘與利用國家地方聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316022)

絕大多數(shù)后生動(dòng)物的線粒體基因組是一個(gè)大小為15～20 kb的雙鏈閉合環(huán)狀DNA 分子，共編碼37 個(gè)基因，包括22 個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA (tRNA) 基因、13 個(gè)蛋白編碼基因(PCGs)和2 個(gè)核糖體RNA (rRNA) 基因；此外基因組中還有1 段長(zhǎng)的非編碼區(qū)，稱為控制區(qū)(control region,CR) 或AT 富集區(qū)(AT-rich)[1]。由于線粒體基因組具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、組成穩(wěn)定、排列保守、不同基因進(jìn)化速率各異等特點(diǎn)，加上近年來測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，其已被廣泛應(yīng)用于物種鑒定、群體遺傳分化以及系統(tǒng)進(jìn)化等研究領(lǐng)域[2-4]。

梭子蟹隸屬于十足目Decapoda 短尾次目Brachyuran 梭子蟹科Portunidae，主要分布于日本、朝鮮、馬來群島、紅海以及我國大陸絕大部分沿海海域。梭子蟹科種類豐富，據(jù)WoRMS 網(wǎng)站記載(http：//www.marinespecies.org/aphia.php?p=taxdetails&id=106763&allchildren=1)，目前該科包括62 屬665 種，我國約有60 余種。很多梭子蟹科種類肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在海洋漁業(yè)中占有重要的經(jīng)濟(jì)地位，如三疣梭子蟹Portunus trituberculatus、紅星梭子蟹P.sanguinolentus、日本蟳Charybdis japonica 和銹斑蟳C.feriata 等[5]。

當(dāng)前大部分研究都聚焦在梭子蟹的漁業(yè)資源、生態(tài)習(xí)性、生長(zhǎng)繁殖及疾病等方面[6-8]，而少有研究系統(tǒng)地關(guān)注梭子蟹科的進(jìn)化歷程及親緣關(guān)系[9-10]。雖然前期有少量研究揭示了梭子蟹科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，但是它們涉及的種類較少，且多數(shù)基于核基因或者線粒體基因片段，包含的有效信息位點(diǎn)十分有限，因而得到的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系并不一致[11-12]。線粒體基因組全序列為研究不同階元系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系提供了良好的分子標(biāo)記，在眾多生物類群都得到了廣泛的應(yīng)用[13-15]。鈍齒蟳Charybdis hellerii，又名赫氏蟳，俗稱石蟳，隸屬于梭子蟹科蟳屬，分布于印度-西太平洋熱帶海域，主要生活在潮間帶礁巖下及長(zhǎng)有水草的積水坑，是我國沿海海域重要的漁業(yè)資源組成部分[5]。目前關(guān)于該物種分子水平研究甚少，本研究首次測(cè)定分析了該物種的線粒體基因組全序列，并結(jié)合Genbank 數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公布的16 種梭子蟹科物種線粒體基因組全序列，構(gòu)建了目前為止最全面的梭子蟹科系統(tǒng)發(fā)育樹，以期為進(jìn)一步探討十足目的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018 年8 月于海南陵水新村附近海域(18°24′39.48″ N，109°58′20.60″ E) 采集鈍齒蟳作為實(shí)驗(yàn)樣品，將新鮮樣品用95%酒精固定后帶回實(shí)驗(yàn)室。取肌肉組織用于基因組DNA的提取，多余組織置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。根?jù)形態(tài)學(xué)特征[5]并輔以NCBI 數(shù)據(jù)庫中線粒體COI 序列（MN184097）鑒定所屬種類。

1.2 基因組DNA 提取

取約30 mg的蟹類螯足肌肉剪碎放入離心管，采用SDS/蛋白酶K 裂解、酚-氯仿抽提法提取總DNA，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 質(zhì)量與濃度，并稀釋為50 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)與PCR 擴(kuò)增

基于三疣梭子蟹和銹斑蟳的線粒體基因組全序列，用Primer-BLAST[16]設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增鈍齒蟳線粒體基因組全序列引物(表1)。在BIO-RAD PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR 反應(yīng)總體積為44 μL，反應(yīng)體系及程序如下：Mix 酶（北京溪洋匯智科技有限公司，規(guī)格1 mL，濃度2x）20.0 μL，ddH2O 18.0 μL，正反引物各2.0 μL，模板2.0 μL；95 ℃變性30 s，48～54 ℃退火50 s，68 ℃延伸1～3 min (35 個(gè)循環(huán))，循環(huán)前先經(jīng)過95 ℃預(yù)變性3 min，循環(huán)后68 ℃繼續(xù)延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相記錄。將目的片段的PCR 產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

表1 鈍齒蟳線粒體擴(kuò)增引物序列Tab.1 Primer pairs for amplification of the complete mitogenome of C.hellerii

1.4 序列拼接、注釋及分析

用Codoncode Aligner 5.1.5 (CodonCode Corporation,Dedham,MA) 將各目的序列進(jìn)行首尾相接，拼接成一個(gè)完整的線粒體基因組全序列。拼接完成后通過MITOS Web Server[17]和tRNAscan-SE[18]確定蛋白質(zhì)基因、tRNA 基因、rRNA 基因以及控制區(qū)的大致位置，再用Sequin 軟件(version 15.10,http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Sequin/) 對(duì)線粒體序列進(jìn)行精準(zhǔn)注釋；利用CGview serve 軟件[19]制作線粒體基因組環(huán)形圖；利用MEGA X[20]計(jì)算基因組堿基組成、氨基酸使用頻率及同義密碼子相對(duì)使用頻率。

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

以紅點(diǎn)月神蟹Ashtoret lunaris 和紅線黎明蟹Matuta planipes 作為外類群，從GenBank 中下載16 種梭子蟹科線粒體基因組全序列，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的鈍齒蟳線粒體基因組全序列(表2)，基于13 種蛋白編碼基因的核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。使用PhyloSuite[21]篩選以上所有物種13 個(gè)蛋白編碼基因，分別用IQTREE[22]和MrBayes 3.2.6[23]構(gòu)建梭子蟹科最大似然樹(ML)和貝葉斯樹(BI)，探究梭子蟹科系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

表2 建樹所用物種線粒體基因組信息Tab.2 List of 17 Portunidae species and two outgroup used in this paper

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體基因組組成及其特征

鈍齒蟳的線粒體基因組(Genbank 登錄號(hào)MW228889)全長(zhǎng)為15 910 bp，包含13 個(gè)蛋白編碼基因，22個(gè)tRNA 基因，2 個(gè)rRNA 基因和1 個(gè)控制區(qū)(CR)。除了8 個(gè)tRNA 基因(tRNA-His、Phe、Pro、Leu1、Val、Gln、Cys、Tyr)、4 個(gè)蛋白編碼基因(ND5、ND4、ND4L、ND1)和2 個(gè)rRNA 基因由輕鏈(L 鏈)編碼外，其它所有基因都由重鏈(H 鏈)編碼(圖1，表3)。鈍齒蟳線粒體基因組的堿基組成為：A(33.8%)、T(36.4%)、G(11.1%)、C(18.7%)，表現(xiàn)出明顯的AT 偏向性(70.2%)。AT-skew 和GC-skew 均為負(fù)值，分別為-0.037 和-0.255(表4)。

表4 鈍齒蟳線粒體基因組核苷酸組成比例Tab.4 Composition and skewness in the mitogenome of C.hellerii

圖1 鈍齒蟳線粒體基因組基因環(huán)形圖Fig.1 Gene map of the C.hellerii mitogenome

鈍齒蟳線粒體基因組不同基因排列比較緊密，基因組中存在8 處共20 bp的重疊區(qū)，其中有4 處重疊基因在后生動(dòng)物線粒體基因組中較為常見：ATP6 與ATP8 之間、ATP8 與COIII 之間、ND4L 與ND4 之間以及ND6 與Cyt b 之間分別存在4 bp、1 bp、7 bp 及1 bp的重疊。雖然基因組整體上排列緊湊，但是在鈍齒蟳線粒體基因組中也發(fā)現(xiàn)了12 處，共354 bp的基因間隔，最長(zhǎng)的間隔長(zhǎng)達(dá)246 bp，位于tRNA-His 和tRNA-Phe 之間；最短的基因間隔為2 bp，存在于多個(gè)位置(表3)。

2.2 蛋白質(zhì)編碼基因

鈍齒蟳線粒體基因組中13 個(gè)蛋白基因的總長(zhǎng)為11 148 bp，共編碼3 722 個(gè)氨基酸。起始與終止密碼子使用情況顯示，所有蛋白質(zhì)編碼基因均以ATN 作為起始密碼子；除了3 個(gè)蛋白編碼基因(COII、COIII 和Cyt b)使用不完全終止密碼子T 外，其余蛋白編碼基因均以TAG 或TAA 作為終止密碼子(表3)。氨基酸使用頻率結(jié)果顯示亮氨酸(Leu)是最常用的氨基酸，占總數(shù)的17.37%，其次是苯丙氨酸(Phe)，占總數(shù)的9.15%，而精氨酸(Arg)是使用頻率最低的氨基酸，僅占1.18%(圖2A)。此外，蛋白編碼基因的相對(duì)同義密碼子使用頻率(RSCU)顯示密碼子UUU(苯丙氨酸)使用次數(shù)最多(239 次)，其次是密碼子UUA(亮氨酸)(233 次)，而密碼子ACG(蘇氨酸)的使用次數(shù)最少，僅有4 次(圖2B，表5)。鈍齒蟳蛋白編碼基因使用頻率較高的密碼子第3 位偏好使用A 和U，與一些短尾派蟹類相似[9,39-40]。

表5 鈍齒蟳線粒體基因組相對(duì)同義密碼子使用頻率(RSCU)Tab.5 The relative synonymous codon usage (RSCU) in the mitogenome of C.hellerii

圖2 鈍齒蟳線粒體基因組氨基酸使用情況(A)及相對(duì)同義密碼子使用頻率(B)Fig.2 The frequency of amino acid (A) and relative synonymous codon usage (RSCU) (B) in the mitogenome of C.hellerii

表3 鈍齒蟳線粒體基因組特征Tab.3 Features of the mitochondrial genome of C.hellerii

2.3 轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)和控制區(qū)(CR)

鈍齒蟳線粒體基因組的22 個(gè)tRNA 中，14 個(gè)由重鏈編碼，其余8 個(gè)由輕鏈編碼，長(zhǎng)度在63(His)-73 bp(Val)之間。除tRNA-Ser1和Thr 外，其余所有tRNA 都能形成典型的三葉草結(jié)構(gòu)(圖3)。tRNA-Ser1缺失二氫尿嘧啶臂(DHU 臂)，tRNA-Thr 不能形成TΨ 環(huán)；前者在后生動(dòng)物線粒體基因組中很常見[41]，而后者卻比較少見。此外，鈍齒蟳線粒體基因組的22 個(gè)tRNA 中共有4 種堿基錯(cuò)配類型，即tRNA-His、Gln 和Met 中各有1 處U-U 錯(cuò)配，tRNA-Lys、Ser2和Cys 中分別有1 處C-U 錯(cuò)配、C-A 錯(cuò)配和A-A 錯(cuò)配，這些堿基錯(cuò)配現(xiàn)象在后生動(dòng)物線粒體tRNA 基因中也很常見[9,10,40]。

圖3 鈍齒蟳線粒體基因組22 個(gè)tRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.3 Secondary structures of the 22 transfer RNA genes in the mitogenome of C.hellerii

鈍齒蟳線粒體基因組包含2 個(gè)rRNA 基因，16S rRNA 和12S rRNA。其中16S rRNA 位于tRNA-Leu1與Val 之間，長(zhǎng)度為1 321 bp，12S rRNA 位于tRNA-Val 與控制區(qū)之間，長(zhǎng)836 bp。兩者AT 含量高達(dá)73.2%，AT-skew 和GC-skew 分別為0.027 和-0.298。12S rRNA的下游是一段長(zhǎng)達(dá)802 bp的非編碼區(qū)，即控制區(qū)(CR)，它跟其它后生動(dòng)物線粒體控制區(qū)一樣，表現(xiàn)出明顯的AT 偏向性(76.3%)。AT-skew 和GCskew 分別為-0.042 和0.347?？刂茀^(qū)是線粒體基因組中進(jìn)化速率最快的區(qū)域，其序列變異程度也最高。本研究比較分析了17 種梭子蟹科的控制區(qū)序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)梭子蟹科控制區(qū)幾乎不存在明顯的保守序列塊。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究基于13 個(gè)蛋白編碼基因的核苷酸序列，以紅點(diǎn)月神蟹和紅線黎明蟹為外類群，同時(shí)構(gòu)建了梭子蟹科的最大似然樹(ML)和貝葉斯樹(BI)。除了分支節(jié)點(diǎn)支持率略有區(qū)別，2 種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹幾乎完全一致。系統(tǒng)樹顯示所有蟳屬和青蟹屬Scylla 物種分別聚為1 支，各形成1 個(gè)單系群；蟳屬物種與短槳蟹屬Thalamita 有著較近的親緣關(guān)系；鈍齒蟳與日本蟳親緣關(guān)系最近。值得注意的是，梭子蟹屬Portunus物種并不是聚為一支形成單系群，而是分為2 支，一支由紅星梭子蟹、遠(yuǎn)海梭子蟹Portunus pelagicus 和三疣梭子蟹3 個(gè)物種組成，另一支則由纖手梭子蟹P.gracilimanus 單個(gè)物種組成(圖4)。

圖4 基于13 個(gè)蛋白編碼基因構(gòu)建的梭子蟹科最大似然樹(ML)和貝葉斯樹(BI)Fig.4 Phylogenetic tree of Portunidae species inferred from the 13 PCGs based on Bayesian inference (BI) and maximum likelihood (ML) analysis.

3 討論

很多梭子蟹種類是世界海產(chǎn)大型經(jīng)濟(jì)蟹類，是沿海漁業(yè)重要組成部分；同時(shí)梭子蟹科種類在海洋生態(tài)系統(tǒng)中也占有十分重要的角色[5,12]。因此，加強(qiáng)對(duì)梭子蟹種類鑒定、群體遺傳結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育等相關(guān)研究，以期為梭子蟹種質(zhì)資源保存、挖掘利用及可持續(xù)發(fā)展提供理論基礎(chǔ)顯得尤為必要。

早期研究蟹類分類主要依靠經(jīng)典的形態(tài)學(xué)方法，由于形態(tài)分類具有一定的主觀性且受環(huán)境因素的影響，因此在蟹類分類及系統(tǒng)發(fā)育研究中很可能得到不一致的結(jié)論。近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，基于分子標(biāo)記的種類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育有效地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法的不足，已在分類和系統(tǒng)學(xué)的研究上解決了很多長(zhǎng)期以有爭(zhēng)議的問題[2,42-43]。但是由于當(dāng)前有關(guān)梭子蟹科的研究主要集中在少數(shù)經(jīng)濟(jì)種類的養(yǎng)殖或群體遺傳結(jié)構(gòu)上[44-45]，很少有關(guān)于梭子蟹科系統(tǒng)發(fā)育的報(bào)道；且多數(shù)研究是基于單個(gè)或少數(shù)線粒體或核基因片段，或者涉及的種類較少[11-12]，關(guān)于梭子蟹科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系尚未得到較全面系統(tǒng)的結(jié)論。

線粒體基因組全序列為研究不同階元系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系提供了良好的分子標(biāo)記，在眾多生物類群都得到了廣泛的應(yīng)用[13-15]。本研究基于線粒體13 個(gè)蛋白編碼基因序列首次構(gòu)建了梭子蟹科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，涉及6屬17 個(gè)物種，這是迄今為止最全面的梭子蟹科分子系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，蟳屬與短槳蟹屬親緣關(guān)系最近，兩者聚支后再與梭子蟹屬相聚，然后再與Monomia 屬和青蟹屬Scylla 相聚。該研究結(jié)果與當(dāng)前絕大多數(shù)基于線粒體基因組全序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系一致[10,46-47]，但是與吳惠仙等[11]基于12S rRNA 序列構(gòu)建的梭子蟹亞科Portuninae 系統(tǒng)關(guān)系略有區(qū)別，雖然其ML 樹也顯示蟳屬與短漿蟹屬親緣關(guān)系最近，但是兩者相聚后先與青蟹屬相聚，然后再與梭子蟹屬相聚；而BI 樹則顯示青蟹屬與梭子蟹屬親緣關(guān)系較近，兩者相聚后再先短漿蟹屬相聚，然后再與蟳屬相聚。雖然還有其它關(guān)于梭子蟹科系統(tǒng)發(fā)育的研究，但是絕大多數(shù)都是基于少量線粒體片段(如COI、Cyt b 和16S rRNA 等)或核糖體序列(如18S rRNA)，且涉及的物種數(shù)較少，因此難以得到準(zhǔn)確一致的結(jié)果[11,12,48]。

我國早期形態(tài)學(xué)家戴愛云等[5]基于纖手梭子蟹頭胸甲具有成群的顆粒，螯足掌節(jié)明顯比長(zhǎng)節(jié)纖細(xì)以及游泳節(jié)長(zhǎng)節(jié)后緣有刺等特征，將其歸于梭子蟹屬，但是本研究及近期分子研究結(jié)果均顯示纖手梭子蟹并不與梭子蟹屬其它種類聚在一起，而其它梭子蟹屬物種則聚為一支，從分子水平支持纖手梭子蟹不應(yīng)該歸屬于梭子蟹屬[10,36]。因此，關(guān)于梭子蟹科是否是單系群，需要包括更多的物種才能定論。