張安龍,文 然,蘇琰儒,張 波*

(1.陜西科技大學(xué) 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710021;2.山西大同大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,山西 大同 037000)

0 引言

微藻是一類能進(jìn)行光合作用的自養(yǎng)微生物,具有個(gè)體微小、分布廣泛、油脂含量高、不占用耕地等特點(diǎn),被廣泛認(rèn)為是最具前景的生物柴油原料[1].微藻可以在各種污水中生長,直接降低二、三級出水中N、P等污染物的含量,利用污水培養(yǎng)微藻可在降低微藻培養(yǎng)成本的同時(shí)實(shí)現(xiàn)廢水的凈化與資源化利用[2].

微藻個(gè)體微小,細(xì)胞直徑一般為5～50μm[3],藻細(xì)胞表面帶有負(fù)電荷,細(xì)胞間存在靜電斥力,在水體中處于穩(wěn)定懸浮的狀態(tài),從而導(dǎo)致微藻細(xì)胞采收難度大[4].現(xiàn)階段,微藻生物質(zhì)采收的方法主要包括離心法、重力沉降法、絮凝法等.其中,絮凝法被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)大規(guī)模收獲微藻的最佳方法.絮凝法是通過電中和、架橋或網(wǎng)捕作用,使分散的帶電荷藻細(xì)胞聚集到一起,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)固液分離[5].以鋁鹽為代表的多價(jià)金屬鹽類是微藻絮凝中應(yīng)用最早的外加絮凝劑[6].影響微藻絮凝的因素主要包括藻細(xì)胞屬性、p H、營養(yǎng)環(huán)境.不同環(huán)境下微藻分泌的胞外有機(jī)物(AOM)產(chǎn)量與組分差異較大[7],AOM的組分主要為多糖和蛋白質(zhì),它們會(huì)與藻細(xì)胞競爭有限的絮凝劑,從而對絮凝效果產(chǎn)生影響[8].

棕鞭藻屬于金藻門,金胞藻目,棕鞭金藻科,棕鞭藻屬;無細(xì)胞壁;個(gè)體微小;在污水環(huán)境中具有較高的生長效率[9].張波等[7]研究表明棕鞭藻在不同營養(yǎng)環(huán)境中自絮凝效率存在差異,棕鞭藻更適合在低pH 條件下的生活污水中絮凝.

微藻培養(yǎng)的主要方式包括自養(yǎng)生長模式(如:BG11培養(yǎng)基)、異養(yǎng)生長模式(如:微藻的高密度培養(yǎng))、混養(yǎng)生長模式(如:利用各類污水進(jìn)行微藻培養(yǎng)).目前,對于絮凝劑種類、絮凝方式以及理化條件對收獲效率的影響有著大量報(bào)道,而不同環(huán)境下微藻絮凝差異及影響機(jī)制尚不明確.

因此,本文以棕鞭藻為研究對象,比較其在BG11培養(yǎng)基、glu+BG11培養(yǎng)基(含10 g/L 葡萄糖的BG11培養(yǎng)基)及生活污水三種環(huán)境中的藻細(xì)胞絮凝效率,并分析微藻AOM 產(chǎn)量及組分的差異,以揭示不同環(huán)境下AOM 組成對微藻絮凝效率的影響機(jī)制.本研究將為在具有復(fù)雜理化條件的污水環(huán)境中建立高效微藻采收體系提供重要指導(dǎo).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

硝酸,分析純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉,分析純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司;葡萄糖,分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;氯化鋁,分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司.

1.1.2 主要儀器

QGZ-500A 智能光照培養(yǎng)箱,杭州琦勝科技有限公司;OPTIMA XPN-10 型低溫超速離心機(jī),美國貝克曼庫爾特公司;Cary 5000 型紫外-可見-近紅外分光光度計(jì),美國安捷倫公司;PHS-25 臺(tái)式數(shù)顯pH 計(jì),上海圣科儀器設(shè)備有限公司.

1.2 微藻來源及培養(yǎng)條件

所用藻株分離自陜西科技大學(xué)人工湖,經(jīng)16S rDNA 序列分析比對鑒定其為棕鞭藻屬Ochromonassp.(Genebank查找號MN028256).利用三種不同的培養(yǎng)基(BG11、glu+BG11、生活污水)培養(yǎng)棕鞭藻,其中,glu+BG11培養(yǎng)基為BG11中添加10 g/L 葡萄糖,生活污水培養(yǎng)基為經(jīng)3 層紗布過濾后再稀釋2倍的生活污水,污水采自陜西科技大學(xué)污水處理廠進(jìn)水口.

取三種培養(yǎng)基各100 mL并置于250 mL三角瓶中,接種微藻懸液至OD540nm 為0.2,光照培養(yǎng)箱內(nèi)震蕩培養(yǎng)7天.光照強(qiáng)度為3 000 lx,溫度28 ℃,光周期L∶D=14 h∶10 h,搖床轉(zhuǎn)速150 r/min.

1.3 微藻絮凝效率測定

吸取10 mL培養(yǎng)至穩(wěn)定期的藻液置于20 mL試管中,加入不同體積的Al3+溶液使得終濃度分別為5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L,并充分震蕩試管.微藻樣品沉降10 min后于液面以下2cm 處取樣,使用分光光度計(jì)測定吸光度并按照公式(1)計(jì)算絮凝效率[10].

式(1)中:OD初始:藻液在540 nm 下絮凝前的吸光度;OD最終:藻液在540 nm 下絮凝后的吸光度.

1.4 微藻AOM 產(chǎn)量與組分分析

取40 mL 藻液置于50 mL 離心管中,5 000 g離心5 min后棄上清,使用0.85%的生理鹽水沖洗,5 000 g離心5 min,重復(fù)三次.再加入0.85%的生理鹽水溶液于50 ℃條件下加熱3 h.將處理后得到的微藻懸浮液于11 000 g 離心15 min,將上清液經(jīng)0.22μm 濾膜過濾,即得到AOM 溶液[11].

取適量AOM 溶液置于50 mL 離心管后用Whatman No.1濾膜進(jìn)行過濾,將濾液于10 000 r/min離心10 min.取上清液,加入等體積的丙酮,在4℃條件下保存48 h后10 000 r/min離心10 min,保留沉淀,冷凍24 h,將所得粉末稱量即為AOM 干重[12].

蛋白質(zhì)含量測定選用考馬斯亮藍(lán)法[13],多糖含量測定選用苯酚-硫酸法[14],多糖組分測定采用離子色譜分析法[15],熒光物質(zhì)測定采用三維熒光光譜分析法[16].

1.5 不同重懸體系下的微藻絮凝效率

設(shè)置以下6種體系進(jìn)行微藻絮凝效率的測定:A,BG11培養(yǎng)基微藻培養(yǎng)液;B,glu+BG11培養(yǎng)基微藻培養(yǎng)液離心后上清重懸BG11的藻細(xì)胞;C,生活污水微藻培養(yǎng)液離心后上清重懸BG11的藻細(xì)胞;D,glu+BG11微藻培養(yǎng)液;E,使用新鮮BG11重懸glu+BG11培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞;F,使用新鮮glu+BG11重懸glu+BG11培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同環(huán)境下棕鞭藻絮凝效率比較

如圖1 所示,棕鞭藻在三種不同環(huán)境中由Al3+誘導(dǎo)的絮凝效率在生活污水中最高,BG11培養(yǎng)基中次之,glu+BG11培養(yǎng)基中最低.Al3+投加量為15 mg/L 時(shí),棕鞭藻在三種環(huán)境中絮凝效率差異最為明顯,生活污水中絮凝效率高達(dá)89%,約為BG11中絮凝效率的1.27倍,glu+BG11中絮凝效率的1.89倍.

圖1 不同環(huán)境下棕鞭藻的絮凝效率比較

Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn),葡萄糖的添加使得同劑量Al3+條件下,藻細(xì)胞絮凝效率顯著下降,其原因是微藻在混養(yǎng)生長時(shí)分泌了大量對絮凝有一定抑制作用的物質(zhì),從而對絮凝效果產(chǎn)生影響glu+BG11培養(yǎng)基中微藻絮凝效率達(dá)到70%時(shí)所需的Al3+劑量為35 mg/L,而在BG11與生活污水中所需的Al3+劑量僅為15 mg/L 和11 mg/L,顯著降低的絮凝劑用量和更高的絮凝效率有利于在生活污水環(huán)境中建立高效、經(jīng)濟(jì)的藻細(xì)胞絮凝收獲體系.在污水環(huán)境中建立高效絮凝收獲體系將進(jìn)一步降低微藻生物柴油制備的成本,對實(shí)現(xiàn)微藻能源產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用具有重要的意義.

2.2 不同重懸體系對棕鞭藻絮凝效率的影響

圖2描述了不同重懸體系對棕鞭藻絮凝效率的影響.相較于BG11培養(yǎng)基(A 體系),使用glu+BG11中微藻培養(yǎng)液離心后的上清重懸BG11中的藻細(xì)胞(B 體系),微藻絮凝效率由A 體系中的87%降低至64%,使用生活污水中微藻培養(yǎng)液離心后的上清重懸BG11中的藻細(xì)胞(C 體系),微藻絮凝效率由A 體系中的87%升至95%(P＜0.05).該現(xiàn)象說明不同環(huán)境中微藻絮凝效率有明顯差異,其中g(shù)lu+BG11培養(yǎng)基對于微藻絮凝有顯著抑制作用.

圖2 不同重懸體系對棕鞭藻絮凝效率的影響

與glu+BG11(D 體系)相比,使用新鮮BG11培養(yǎng)基重懸glu+BG11培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞(E體系)絮凝效率由D體系中的60%升至83%,使用新鮮glu+BG11培養(yǎng)基重懸glu+BG11培養(yǎng)液中的藻細(xì)胞(F體系)絮凝效率由D 體系中的60%升至80%(P＜0.05).該現(xiàn)象說明在glu+BG11培養(yǎng)基中藻細(xì)胞絮凝受到抑制是由于微藻在生長代謝中分泌的某種物質(zhì),而并非是培養(yǎng)基中葡萄糖本身的作用.趙菲[18]研究發(fā)現(xiàn),不同碳源對微藻自絮凝的影響有顯著差異,其中以淀粉為碳源的微藻在培養(yǎng)過程中分泌較高含量的AOM 使得微藻絮凝效率較低,其原因是在易代謝碳源缺乏的脅迫作用下促進(jìn)了AOM的產(chǎn)生,從而影響微藻的絮凝效率.

2.3 不同環(huán)境下棕鞭藻AOM 的產(chǎn)量

不同環(huán)境對棕鞭藻AOM 產(chǎn)量的影響如圖3所示.在不同pH 條件下,棕鞭藻在glu+BG11中AOM 產(chǎn)量均最高,BG11 中次之,生活污水中最低.這是因?yàn)樵寮?xì)胞在利用有機(jī)碳源的過程中代謝途徑不同而導(dǎo)致的,此外在培養(yǎng)介質(zhì)中不同C/N比也會(huì)對AOM 產(chǎn)量產(chǎn)生影響[19].當(dāng)pH 為11時(shí),BG11、glu+BG11、生活污水三種環(huán)境中AOM 產(chǎn)量均達(dá)到最大值,分別為0.042 g/L、0.109 g/L、0.036 g/L.當(dāng)pH 為2時(shí),glu+BG11中AOM 產(chǎn)量約為BG11中AOM 產(chǎn)量的2.5倍,生活污水中AOM 產(chǎn)量的3.8倍(P＜0.05).張波等[7]研究發(fā)現(xiàn),在glu+BG11培養(yǎng)基中當(dāng)pH 為11時(shí)棕鞭藻絮凝效率低至21.2%,在生活污水中當(dāng)pH 為2時(shí)棕鞭藻絮凝效率高達(dá)86.01%,這與微藻在不同pH 條件下AOM 的產(chǎn)量不同有關(guān).Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)微藻AOM 產(chǎn)量與培養(yǎng)基中的有機(jī)物成分有關(guān),有機(jī)碳源的添加會(huì)促進(jìn)微藻產(chǎn)生大量的AOM.AOM 中含有大量的胞外多糖,由于胞外多糖中包含負(fù)電荷的基團(tuán)能夠與溶液中帶有正電荷的離子產(chǎn)生電中和作用,從而對微藻的絮凝產(chǎn)生抑制作用.

圖3 不同環(huán)境對棕鞭藻AOM 產(chǎn)量的影響

2.4 不同環(huán)境下棕鞭藻AOM 的組分分析

2.4.1 AOM 中多糖與蛋白質(zhì)含量

如圖4所示,用不同環(huán)境培養(yǎng)的微藻AOM 中多糖含量為0.002～0.021 g/L,多糖含量差異明顯.glu+BG11 培養(yǎng)基中多糖含量最高,BG11 培養(yǎng)基次之,生活污水最低.Dries Vandamme等[21]研究發(fā)現(xiàn),斜生柵藻自絮凝過程受到抑制是因?yàn)槿芤褐械亩嗵桥c磷酸鹽競爭從而干擾Ca3(PO4)2晶體的形成,且多糖中主要是陰離子多糖發(fā)揮抑制絮凝作用,如葡萄糖醛酸.

圖4 不同環(huán)境下棕鞭藻AOM 中多糖與蛋白質(zhì)含量

BG11、glu+BG11、生活污水三種環(huán)境中蛋白質(zhì)含量較為接近,蛋白質(zhì)/多糖的比例依次為4.429、1.571、15(P＜0.05).Huang等[22]研究表明AOM 中蛋白質(zhì)是疏水官能團(tuán)的重要來源,對藻細(xì)胞的橋接具有一定作用,蛋白質(zhì)/多糖越高,微藻細(xì)胞之間連接就越緊密,從而促進(jìn)了絮凝.這與圖1中棕鞭藻在三種不同環(huán)境下由Al3+誘導(dǎo)的絮凝效率在生活污水中最高,BG11培養(yǎng)基中次之,glu+BG11培養(yǎng)基中最低結(jié)果相一致.

2.4.2 AOM 中單糖組成及含量

表1描述了棕鞭藻在不同環(huán)境中所產(chǎn)AOM的單糖組成以及含量.glu+BG11 培養(yǎng)基所產(chǎn)AOM 的單糖種類最多(5種),其次為生活污水(4種)、BG11培養(yǎng)基(3種).陳潮州[19]研究發(fā)現(xiàn)以葡萄糖為碳源的微藻AOM 檢測到6種單糖、以乙酸鈉為碳源的微藻AOM 中檢測到8種單糖;Alam等[23]發(fā)現(xiàn)了小球藻的多糖由葡萄糖、甘露糖和半乳糖組成;Mishra等[24]發(fā)現(xiàn)D.salina胞外多糖中含有半乳糖、葡萄糖、木糖和果糖四種單糖;Shi等[25]發(fā)現(xiàn)C.pyrenoidosa的多糖主要由甘露糖和葡萄糖組成.由此表明,不同環(huán)境、微藻種屬差異會(huì)對AOM 單糖的組成產(chǎn)生重要影響.

表1 不同環(huán)境下棕鞭藻所產(chǎn)AOM 的單糖組成

在glu+BG11培養(yǎng)基中,阿拉伯糖產(chǎn)量最多,鼠李糖產(chǎn)量最少僅為0.973 mg/L,阿拉伯糖的產(chǎn)量約為鼠李糖的13倍.在生活污水中,鼠李糖的含量最高約為1.574 mg/L,半乳糖的含量最少僅為0.032 mg/L,鼠李糖的含量高于巖藻糖、葡萄糖、半乳糖總含量之和.微藻AOM 中單糖組成的差異會(huì)影響藻細(xì)胞的絮凝效率,Rashid等[26]研究發(fā)現(xiàn)巖藻糖比其他單糖親水性弱、疏水性強(qiáng),阿拉伯糖能夠抑制細(xì)胞聚集特性,鼠李糖與半乳糖為藻細(xì)胞生長提供能源.

2.4.3 AOM 的三維熒光光譜分析

棕鞭藻所產(chǎn)AOM 的三維熒光光譜圖如圖5所示.結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同環(huán)境下棕鞭藻所產(chǎn)AOM 均存在類蛋白熒光峰(A 峰,λex/em=225～250/280～360nm)與酪氨酸熒光峰(B峰,λex/em=260～290/300～330nm),可見富里酸熒光峰(C峰,λex/em=240～260/430～460nm)僅存在于BG11培養(yǎng)基中.

圖5 不同環(huán)境下棕鞭藻AOM 的三維熒光光譜圖

glu+BG11培養(yǎng)基中棕鞭藻所產(chǎn)AOM 的類蛋白A 峰、酪氨酸B 峰熒光強(qiáng)度明顯高于BG11培養(yǎng)基、生活污水,這與有機(jī)碳源促進(jìn)棕鞭藻生成大量的AOM 有關(guān).在glu+BG11培養(yǎng)基中,棕鞭藻細(xì)胞快速生長,使得藻細(xì)胞更快達(dá)到生長衰減期,衰老、死亡的藻細(xì)胞會(huì)釋放出大量的熒光物質(zhì),從而導(dǎo)致熒光物質(zhì)強(qiáng)度增強(qiáng).類蛋白與可溶性微生物副產(chǎn)物較易被微生物降解利用,并且微生物在利用糖類、蛋白類化合物時(shí),會(huì)造成腐殖酸等大分子物質(zhì)的積累.同時(shí),藻類胞外有機(jī)物所含熒光物質(zhì)的強(qiáng)度、類型與藻種、生長階段、生長環(huán)境均有關(guān),曾滟[27]研究發(fā)現(xiàn),銅綠微囊藻在生長穩(wěn)定期會(huì)較多地利用熒光物質(zhì)中容易吸收的酪氨酸和類色氨酸維持生命,而在生長適應(yīng)期或衰亡期更多的是利用溶液中的非熒光物質(zhì)維持生長繁殖.

3 結(jié)論

棕鞭藻在生活污水中具有最高的絮凝效率與最低的AOM 產(chǎn)量,在含糖體系中由于葡萄糖的添加使得微藻AOM 產(chǎn)量顯著增加,進(jìn)而對藻細(xì)胞絮凝產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制.與此同時(shí),含糖體系中的AOM所含的單糖種類最多且阿拉伯糖含量最高,而生活污水中AOM 單糖組分以鼠李糖為主.