劉 寧,任 歌,賀人杰,李道明,陳雪峰,房 斐,于哲雄,王金霞,陳西軍

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院,陜西 西安 710021;2.陜西農產(chǎn)品加工技術研究院,陜西 西安 710021;3.寧夏天仁枸杞生物科技股份有限公司,寧夏 中寧 755100;4.陜西安康花旗食品有限公司,陜西安康 725000)

0 引言

近年來,隨著枸杞種植和加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,枸杞濃縮汁、枸杞飲料、枸杞果酒等產(chǎn)量不斷增大,產(chǎn)生大量的加工廢棄物--枸杞渣,一方面造成環(huán)境污染,另一方面造成大量資源浪費,這已成為枸杞加工業(yè)迫切需要解決的瓶頸問題[1,2].

多糖的分子結構與生物活性緊密相關,對多糖分子進行接枝功能基團可提高多糖活性.近年來,多糖的改性成為研究熱點之一[3].多糖分子改性常用的方法有化學、物理和生物三種,其中化學改性的方法主要有硫酸化、烷基化、磷酸化、硒化、乙?；?、羧甲基化等[4].已有研究[5]表明,多糖經(jīng)化學修飾后其抗腫瘤活性顯著提高.乙酰化改性是在多糖分子的支鏈上引入乙?；姆磻?并使多糖的支鏈充分展開,暴露出更多糖內固有的羥基或羧基,從而改善其水溶性,提高其生物活性.

張麗程等[6]對茯磚茶多糖進行乙?；揎?乙?；〈葹?.214,研究發(fā)現(xiàn)0.18 mg/m L的茯磚茶多糖和乙?；瓒嗵菍Ζ?葡萄糖苷酶的抑制率分別為90.3%和92.2%.張春潔等[7]研究發(fā)現(xiàn)海鮮菇多糖乙?；〈冗_到0.602,與海鮮菇多糖相比體外抗氧化活性大大增強.鞏麗虹等[8]研究發(fā)現(xiàn)制備乙?；里L多糖的最佳試驗條件為:乙酸酐用量7 mL、反應溫度40 ℃、反應時間4 h,乙?；嗵菍ΑH 和DPPH·的清除能力顯著增強.蔡婉靜等[9]研究發(fā)現(xiàn)超聲降解和醋酸干法聯(lián)合處理海帶多糖,可改善海帶多糖理化性質,并顯著提高其體外抗氧化能力及吸濕/保濕能力.因此,本研究將對擠壓后的枸杞渣多糖進行乙酰化修飾,并探究其修飾前后結構變化.

本研究采用單因素和正交試驗對乙?；坭皆嗵堑淖顑?yōu)制備工藝參數(shù)進行探究,以乙酰基取代度為評價指標,考察反應時間、乙酸酐添加量和反應溫度等三個因素對枸杞渣多糖乙酰化修飾效果的影響,并利用掃描電鏡和紅外光譜對其進行表征,旨在為枸杞渣多糖的下一步研究奠定理論基礎.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞渣,寧夏天仁枸杞生物科技股份有限公司;乙醇(95%)、乙酸酐、氯化鈉、溴化鉀,天津市科密歐化學試劑有限公司;氫氧化鈉、酚酞、無水乙醇,天津市天力化學試劑有限公司;濃鹽酸,天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠;Φ45 mm 透析袋(8000-14000 Da),Microdialysis Chambers公司.以上試劑均為分析純.

1.2 儀器與設備

SYSLG30-IV 雙螺桿擠壓機,濟南賽百諾科技開發(fā)有限公司;FEI Q45環(huán)境掃描電子顯微鏡,美國FEI公司;Vertex70 紅外光譜儀,德國Bruker公司;FD-1D-50冷凍干燥機,上海比朗儀器制造有限公司;H-1850R 臺式高速冷凍離心機,長沙湘儀離心機儀器有限公司;RE-2000B 旋轉蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠;LDP-200高速多功能粉碎機,浙江永康市紅太陽機電有限公司.

1.3 試驗方法

1.3.1 枸杞渣多糖的提取

將枸杞渣進行擠壓改性,擠壓工藝為:物料粒度40目、加水量30%(質量分數(shù))、螺桿轉速210 r/min、靜置時間60 min,獲得擠壓改性枸杞渣.準確稱取5.0 g擠壓改性枸杞渣,加入125 mL 去離子水,于60℃恒溫浸提3 h,待冷卻至25℃后,以5 000 r/min離心10 min,取上清液,將上清液濃縮至原體積的1/5,向濃縮液中加入4倍體積95%的乙醇進行醇沉,于4℃下放置12 h,沉淀物用蒸餾水復溶后旋轉蒸發(fā)除去有機溶劑,凍干后即得枸杞渣多糖.

1.3.2 乙?；坭皆嗵堑闹苽?/p>

參照陳金龍[10]的方法,具體步驟如下:先準確稱量一定量的枸杞渣多糖,用超純水溶解樣品,加入NaOH 調節(jié)溶液的pH 約9.0,10 min后緩慢加入一定量的乙酸酐,乙酸酐的添加分5次進行,整個反應過程的pH 維持在9.0左右,待所有的乙酸酐添加完畢,恒溫反應一段時間,將溶液的pH 調為中性,流水透析2 d以除去小分子物質,置于冷凍室下冷凍12 h,于冷凍干燥機中凍干后即得乙?；坭皆嗵?

1.3.3 乙?；坭皆嗵侨〈鹊臏y定

乙?；坭皆嗵堑娜〈葴y定根據(jù)酸堿滴定法[11],具體步驟如下:準確稱取20.0 mg乙酰化枸杞渣多糖,用濃度為0.01 mol/L 的氫氧化鈉溶液與多糖樣品混合均勻,于50 ℃恒溫下保持2 h,劇烈搖動使之充分皂化.酚酞溶液作指示劑,用0.01 mol/L鹽酸溶液滴定,紅色消失為滴定終點.在充分皂化時會發(fā)生多糖降解,從而產(chǎn)生氫氧化鈉的消耗.因此,需作空白對照減少誤差.乙?；〈?DS)計算公式如下:

式(1)中:A為乙酰基含量,%;V0為加入的氫氧化鈉溶液的體積,m L;C0為加入的氫氧化鈉溶液的濃度,mol/L;V1為加入的鹽酸溶液的體積,m L;C1為加入的鹽酸溶液的濃度,mol/L;m為待測樣品質量,g.

式(2)中:DS為乙?；〈?A為乙酰基含量,%.

1.3.4 單因素試驗設計

(1)反應時間對枸杞渣多糖乙?；Ч挠绊?/p>

稱取0.1 g枸杞渣多糖置于燒杯中,加入一定量的超純水溶解多糖,用堿液調節(jié)pH 約為9.0,選定乙酸酐的添加量為15 mL,在50 ℃下緩慢加入乙酸酐,整個反應pH 維持在9.0左右,待乙酸酐添加完畢,于恒溫條件分別反應1 h、2 h、3 h、4 h、5 h,用酸液調節(jié)pH 約為7.0,冷凍干燥得乙酰化多糖,測定乙?；〈?

(2)乙酸酐添加量對枸杞渣多糖乙?；Ч挠绊?/p>

稱取0.1 g枸杞渣多糖置于燒杯中,加入一定量的超純水溶解多糖,用堿液調節(jié)pH 約為9.0,分別取5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL 的乙酸酐,在50 ℃下緩慢加入乙酸酐,整個反應pH 維持在9.0左右,待乙酸酐添加完畢,于恒溫條件下反應4 h,用酸液調節(jié)pH 約為7.0,冷凍干燥得乙酰化多糖,測定乙?；〈?

(3)反應溫度對枸杞渣多糖乙?；Ч挠绊?/p>

稱取0.1 g枸杞渣多糖置于燒杯中,加入一定量的超純水溶解多糖,用堿液調節(jié)pH 約為9.0,乙酸酐的添加量為15 mL,分別于50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃下緩慢加入乙酸酐,整個反應pH 維持在9.0左右,待乙酸酐添加完畢,于恒溫條件下反應4 h,用酸液調節(jié)pH 約為7.0,冷凍干燥得乙酰化多糖,測定乙?；〈?

1.3.5 正交試驗設計

在單因素試驗基礎上,取枸杞渣多糖添加量0.1 g,選取反應時間、乙酸酐添加量、反應溫度為因素,以乙酰基取代度為評價指標,設計3因素3水平,進行正交優(yōu)化試驗,其因素及水平設計見表1所示.

表1 正交試驗因素水平表

1.3.6 乙?；揎椙昂箬坭皆嗵菕呙桦婄R分析

分別稱取適量枸杞渣多糖、乙?；坭皆嗵菢悠酚谳d物臺上,噴金處理30 s,將載物臺置于儀器內,調整不同倍數(shù)以觀察其微觀結構.

1.3.7 乙?；揎椙昂箬坭皆嗵羌t外光譜圖分析

稱取枸杞渣多糖和乙酰化枸杞渣多糖樣品各5.0 mg,加入500.0 mg KBr混勻研磨,在波數(shù)范圍為4 000～400cm-1內進行紅外掃描,并繪制紅外譜圖.

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

每組數(shù)據(jù)重復測定3次取平均值,通過SPSS 17.0軟件計算數(shù)據(jù)差異顯著性分析,通過Origin 9.0軟件作圖分析.

2 結果與討論

2.1 反應時間對枸杞渣多糖乙?；Ч挠绊?/h3>

預設反應溫度50 ℃,枸杞渣多糖添加量為0.1 g,乙酸酐添加量為15 mL,考察反應時間對乙酰化效果的影響,結果見圖1所示.由圖1可知,乙?；〈入S著反應時間的延長呈現(xiàn)先增后減的趨勢.當反應時間從1 h到4 h時,乙酰基取代度隨著反應時間的延長而顯著升高;當反應時間為4 h時,取代度達到最大值0.429;當反應時間從4 h到5 h時,乙?；〈入S著反應時間的延長而顯著降低.這可能是由于反應時間過長引起多糖降解,因此確定反應時間為4 h.

圖1 反應時間對枸杞渣多糖取代度的影響

2.2 乙酸酐添加量對枸杞渣多糖乙?；Ч挠绊?/h3>

預設反應溫度50 ℃,枸杞渣多糖添加量為0.1 g,反應時間為4 h,考察乙酸酐添加量對乙?；Ч挠绊?結果見圖2所示.由圖2可知,乙酰基取代度隨著乙酸酐添加量增加呈現(xiàn)先增后平穩(wěn)的趨勢.當乙酸酐添加量處于5～15 mL 范圍內,乙?；〈蕊@著升高;當乙酸酐添加量為15 mL時,乙?；坭皆嗵堑娜〈茸罡邽?.431;當乙酸酐添加量處于15～25 mL 范圍內,乙酰基取代度基本趨于平穩(wěn).這可能是因為多糖與乙酸酐試劑按照一定比例反應,當乙酸酐添加量為15 mL時,剛好與0.1 g多糖完全反應.因此綜合考慮確定乙酸酐添加量為15 mL.

圖2 乙酸酐添加量對枸杞渣多糖取代度的影響

2.3 反應溫度對枸杞渣多糖乙?；Ч挠绊?/h3>

預設反應時間4 h,枸杞渣多糖添加量為0.1 g,乙酸酐添加量為15 mL,考察反應溫度對乙?；Ч挠绊?結果如圖3所示.由圖3可知,乙?；〈入S著反應溫度升高呈現(xiàn)先增后減的趨勢.當乙?；磻_始前,通常會加入一定量的NaOH 溶液,使酸性物質與堿液發(fā)生反應,以此提高枸杞渣多糖溶解度[12].當反應溫度處于50℃～60℃范圍時,乙酰基取代度顯著升高;當反應溫度為60 ℃時,乙?；〈茸罡邽?.453,此時乙?；Ч罴?當反應溫度處于60 ℃～90 ℃范圍時,乙酰基取代度顯著下降,這說明反應溫度過高對多糖和乙酸酐試劑的取代反應有不利影響[13],因此確定反應溫度為60℃.

圖3 反應溫度對枸杞渣多糖取代度的影響

2.4 正交試驗結果

以反應時間、乙酸酐添加量、反應溫度為變量,以乙酰基取代度為考察值,通過正交試驗對乙?；坭皆嗵侵苽涔に囘M行了優(yōu)化,結果見表2所示.

表2 正交試驗設計及結果

由表2分析可得,因素B(乙酸酐添加量)對枸杞渣多糖乙?；揎椥Ч绊戯@著(p＜0.05),因素A(反應時間)、因素C(反應溫度)對枸杞渣多糖乙?；揎椥Ч绊懖伙@著,各因素影響的大小順序為:B＞C＞A.乙酰化枸杞渣多糖最佳制備工藝為A2B2C2,即枸杞渣多糖添加量為0.1 g時,反應時間4 h,乙酸酐添加量15 mL,反應溫度60℃.在該條件下進行重復性驗證試驗,可得乙?；坭皆嗵侨〈葹?.454,均高于優(yōu)化之前.

2.5 乙酰化修飾前后枸杞渣多糖的掃描電鏡分析

圖4為乙?；揎椙昂箬坭皆嗵堑膾呙桦婄R圖.由圖4可以發(fā)現(xiàn),乙酰化修飾前,多糖結構致密,表面較為光滑平整.乙?；揎椇?多糖表面變得粗糙且不平整,有明顯褶皺.這可能是由于乙酰化修飾使得多糖內部結構發(fā)生了改變,從而引起表面形貌的變化.

圖4 乙?；揎椙昂箬坭皆嗵菕呙桦婄R圖

2.6 乙酰化修飾前后枸杞渣多糖紅外光譜分析

圖5(a)、(b)分別為乙?；揎椙昂托揎椇箬坭皆嗵堑募t外光譜圖.由圖可知,乙?；揎椙昂箬坭皆嗵蔷哂卸嗵堑奶卣魑辗錥14],3 400cm-1附近為多糖分子中的-OH 振動吸收峰,2 900cm-1附近為糖類C-H鍵的伸縮振動峰,1 300～1 000cm-1附近為C-O的伸縮振動峰,1 600cm-1和1 400cm-1附近處的吸收峰為羧基伸縮振動峰.乙?；揎椇?多糖在1 746cm-1處出現(xiàn)了新的吸收峰,這可能是由于酯基中C=O的伸縮振動所引起的[14].由此可見,枸杞渣多糖中成功引入乙?；?

圖5 乙?；揎椙昂箬坭皆嗵羌t外光譜圖

3 結論

對枸杞渣多糖進行乙?；揎?結果表明,試驗各因素對乙?；〈扔绊懘笮∫来螢?乙酸酐添加量＞反應溫度＞反應時間,最佳制備工藝為:枸杞渣多糖添加量為0.1 g,反應時間4 h,乙酸酐添加量15 mL,反應溫度60℃,此時乙?；〈葹?.454.紅外光譜結果顯示,多糖被乙?；揎椇?出現(xiàn)新的酯基C=O 伸縮振動吸收峰.較多研究結果表明[3,15-19],對多糖進行乙?；揎椏商岣叨嗵堑捏w外抗氧化活性、抗炎活性及免疫活性等,使其更有可能在功能食品和醫(yī)藥行業(yè)應用.下一步,將對乙酰化枸杞渣多糖的抗氧化和免疫活性等進行研究,以期為枸杞渣的高值化利用提供理論參考.