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AR-V7對(duì)前列腺癌細(xì)胞增長(zhǎng)及Akt/mTOR信號(hào)通路的影響

2021-10-29 09:04艾孜麥提阿不都熱合曼馬東升安恒慶
關(guān)鍵詞:空白對(duì)照通路載體

艾孜麥提·阿不都熱合曼, 馬東升, 安恒慶,2

(新疆醫(yī)科大學(xué)1第一附屬醫(yī)院泌尿外科, 2公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)博士后流動(dòng)站,烏魯木齊 830011)

前列腺癌(prostate cancer,PCA)是男性泌尿生殖系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤,按世界衛(wèi)生組織(world health organization,WHO)2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì),在世界范圍內(nèi),其發(fā)病率在男性所有惡性腫瘤中位居第二位,僅次于肺癌[1]。我國(guó)PCA 的發(fā)病率和死亡率近年來(lái)呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)[2]。雄激素受體(androgen re?ceptor, AR)在PCA 的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起重要作用,前列腺中主要的雄激素是雙氫睪酮,與胞質(zhì)內(nèi)AR結(jié)合后,促進(jìn)類固醇-受體復(fù)合物進(jìn)入核內(nèi),激活雄激素反應(yīng)元件(androgen response elements,ARE),調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。正常情況下AR 信號(hào)通路促進(jìn)前列腺上皮細(xì)胞的分化,而異常的信號(hào)通路則會(huì)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、存活、增殖, 從而使得腫瘤惡化[3]。雄激素剝奪治療(androgen deprivation therapy,ADT)是PCA 患者中首先的治療方案,但經(jīng)過(guò)中位時(shí)間18~24個(gè)月的內(nèi)分泌治療后,幾乎所有患者都進(jìn)展為去勢(shì)抵抗型PCA(castration resistant prostate cancer,CRPC)[4]。CRPC 其調(diào)控機(jī)制和作用機(jī)制尚未完全闡明,不過(guò)已有研究結(jié)果提示AR 信號(hào)持續(xù)激活是CRPC 發(fā)生發(fā)展的重要原因,其中AR-V7是AR信號(hào)通路在低雄激素水平的環(huán)境中能被激活的原因之一[5-6]。磷脂酰肌醇3 激酶/絲氨酸蘇氨酸激酶/雷帕霉素激酶(PI3k/AKT/mTOR)信號(hào)通路對(duì)疾病發(fā)病有著重要作用,PCA 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)PI3k/AKT 信號(hào)通路經(jīng)常被異常激活,并已被證明在CRPC 進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[7-9]。AR 和Akt/mTOR 通路的相互反饋激活已被證實(shí),癌細(xì)胞在其中一個(gè)途徑被藥物抑制時(shí)適應(yīng)另一個(gè)途徑生存[10-11]。本研究將pIRES2-EGFP-AR-V7 接種于PC-3 細(xì)胞,驗(yàn)證AR-V7 的表達(dá)情況,隨后檢測(cè)Akt、mTOR、p-AKT、p-mTOR 的蛋白和基因水平,探討AR-V7 與Akt/mTOR 通路之間的相互作用,為CRPC的機(jī)制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑PC-3 細(xì)胞來(lái)源于豐輝生物,胎牛血清(FBS)(Excell Bio 公司),Lipofectamine 3000? Transfection Reagent(Invitrogen 公司),pIRES2-EGFP 空載質(zhì)粒(新疆昆泰銳生物公司),SmaI 內(nèi)切酶、PmlI 內(nèi)切酶(NEB 公司),T4 DNA Ligase(takara 公司),Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell、pEASY?-T1Cloning Kit、CCK-8 細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑盒(全式金生物公司),AnnexinVPE/7AAD Kit(BD公 司), TRIzol ?Reagen(ambion 公 司), Akt(pan)(C67E)RabbitmAb, Phospho-Akt(Ser473)Antibody, mTOR(7C10)RabbitmA(CST 公司),Real Time PCR instrument(ABI公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)PC-3 細(xì)胞用含1% 青-鏈霉素、10%胎牛血清的F-12K 培養(yǎng)基、在含5% 的CO2和飽和濕度37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),將處在生長(zhǎng)狀態(tài)下的細(xì)胞進(jìn)行傳代。

1.3 pIRES2-EGFP-AR-V7 重組質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染使用全基因化學(xué)合成的方法合成AR-V7 CDS區(qū)序列,連接到pIRES2-EGFP 表達(dá)質(zhì)粒載體上,取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-3 細(xì)胞,按Lipofectamine3000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)分別將pIRES2-EGFP 空載質(zhì)粒及pIRES2-EGFP-AR-V7 重組載體傳染PC-3 細(xì)胞,并且為后續(xù)實(shí)驗(yàn)確定最佳轉(zhuǎn)染條件。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組AR-V7 重組載體組(pIRES2-EGFPAR-V7 過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒傳染PC-3 細(xì)胞,轉(zhuǎn)染試劑濃度0.75 μL/mL,轉(zhuǎn)染時(shí)間48 h),空載對(duì)照組(pIRES2-EGFP 空載質(zhì)粒傳染PC-3 細(xì)胞,轉(zhuǎn)染試劑濃度0.75μL/mL,轉(zhuǎn)染時(shí)間48 h),空白對(duì)照組(正常培養(yǎng)48 h)。

1.5 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞增殖取生長(zhǎng)狀態(tài)良好匯合率達(dá)90% 的PC-3 細(xì)胞,按照1.4 實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染,每組5重復(fù)。干預(yù)完成后,棄去培養(yǎng)基,每孔加入10 μL配置好的10% CCK-8 溶液,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育,2 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的OD值。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好匯合率達(dá)90% 的PC-3 細(xì)胞,按1.4 實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)細(xì)胞,將每組細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液吸出至離心管內(nèi)(內(nèi)含已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞),PBS 洗滌貼壁細(xì)胞2 次,將PBS 一并收集至離心管內(nèi),胰酶消化細(xì)胞,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi),1000 r/min 離心5 min,棄上清。用預(yù)冷的PBS 洗滌2 遍,棄上清。加入500 μL 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞,過(guò)200 目篩網(wǎng),制成單細(xì)胞懸液。每管加入5 μL Annexin V-PE 和10 μL 7-AAD,輕輕混勻,4℃避光放置5 min。在30 min 內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)檢測(cè)AKT、mTOR 基因表達(dá)按1.4實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)完成后,棄去每組細(xì)胞瓶中的培養(yǎng)基,加入1 mL Trizol 消化細(xì)胞,使Trizol 平鋪在細(xì)胞層面上,反復(fù)搖晃細(xì)胞培養(yǎng)瓶,裝入1.5 mL EP管中。后續(xù)實(shí)驗(yàn)按照qRT-PCR實(shí)驗(yàn)報(bào)告操作。

1.8 蛋白免疫印跡法(western blot,WB)檢測(cè)AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR 蛋白表達(dá)按1.4 實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)完成后,棄去每組細(xì)胞瓶中的培養(yǎng)基,加入3 mL 無(wú)菌的PBS 緩沖液反 復(fù) 沖 洗2 遍,棄去PBS 緩沖液,用胰酶消化細(xì)胞。離心后棄去上清留細(xì)胞沉淀,用5 mL 無(wú)菌PBS 洗1 遍后收集細(xì)胞。后續(xù)實(shí)驗(yàn)按照WB實(shí)驗(yàn)報(bào)告操作。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 24.0軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)性、方差齊的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差做統(tǒng)計(jì)描述,多組比較采用單因素方法分析,兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料用百分比形式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述,兩組比較采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 驗(yàn)證3組AR-V7基因及蛋白表達(dá)水平AR-V7基因過(guò)表達(dá)后AR-V7 mRNA 在AR-V7 重組載體組中的表達(dá)水平(11.740±1.968)明顯高于空白對(duì)照組(1.003±0.090)、空載對(duì)照組(1.121±0.125),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),AR-V7 的蛋白表達(dá)水平在AR-V7重組載體組中的表達(dá)水平(0.722±0.043)明顯高于空白對(duì)照組(0.283±0.161)、空載對(duì)照組(0.219±0.084),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1、2。

圖1 3組AR-V7 mRNA表達(dá)量圖

圖2 3組WB實(shí)驗(yàn)條帶圖及柱狀圖

2.2 3組細(xì)胞增殖活性比較PC-3細(xì)胞在AR-V7重組載體組中的增殖活性(OD=0.967±0.037)明顯高于 空 白 對(duì) 照 組(OD=0.981±0.049)、空 載 對(duì) 照 組(OD=0.967±0.037),差 異 均 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義(P<0.05),見(jiàn)圖3。

圖3 3組細(xì)胞增殖柱狀圖

2.3 3 組細(xì)胞凋亡率比較空白對(duì)照組、空載對(duì)照組、AR-V7 重組載體組細(xì)胞凋亡率分別為(6.103±0.870)%、(6.320±0.949)%、(5.000±0.881)%,各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖4。

圖4 3組細(xì)胞凋亡流式圖

2.4 Akt、mTOR 基因表達(dá)水平Akt 基因表達(dá)水平在各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),mTOR 基因表達(dá)水平在各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1、圖5。

圖5 各組AKT和mTOR基因表達(dá)柱狀圖

表1 PC-3細(xì)胞中各基因表達(dá)水平分析(±s)

表1 PC-3細(xì)胞中各基因表達(dá)水平分析(±s)

分組空白對(duì)照組空載對(duì)照組AR-V7重組載體組AKT 1.019±0.231 0.987±0.127 1.333±0.211 mTOR 1.017±0.219 1.064±0.108 1.389±0.507

2.5 Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 蛋白表達(dá)水平p-Akt 和p-mTOR 蛋白在AR-V7 重組載體組中的表達(dá)水平明顯低于兩個(gè)對(duì)照組(P<0.05)。各組Akt及mTOR蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P>0.05),見(jiàn)表2、圖6。

圖6 PC-3細(xì)胞中各蛋白表達(dá)水平的柱狀圖

表2 PC-3細(xì)胞中各蛋白的表達(dá)水平分析(±s)

表2 PC-3細(xì)胞中各蛋白的表達(dá)水平分析(±s)

注:與空白對(duì)照組相比,△P<0.05;與空載對(duì)照組相比,▲P<0.05。

分組空白對(duì)照組空載對(duì)照組AR-V7重組載體組AKT 0.702±0.024 0.670±0.034 0.685±0.029 p-AKT 0.833±0.099 0.850±0.045 0.529±0.071△▲mTOR 0.595±0.046 0.579±0.027 0.580±0.031 p-mTOR 0.581±0.024 0.561±0.046 0.297±0.021△▲

3 討論

PCA 初診時(shí)多數(shù)已屬中晚期。內(nèi)分泌治療是中晚期PCA 患者的基礎(chǔ)治療,但最后絕大部分患者仍然無(wú)法避免藥物抵抗的事實(shí),從而進(jìn)入CRPC 階段,常規(guī)的內(nèi)分泌治療往往對(duì)這些患者病情的改善并無(wú)太大的作用[12]。CRPC 的機(jī)制目前尚不明確,相關(guān)分子網(wǎng)絡(luò)較為復(fù)雜,多條信號(hào)通路協(xié)同參與,同時(shí)隨疾病的進(jìn)展而變化,已有研究表明,在CRPC 階段中AR信號(hào)持續(xù)激活促進(jìn)PCa 細(xì)胞的存活,其中AR 通路被激活的原因包括AR 基因的突變、擴(kuò)增、剪接突變體產(chǎn)生、蛋白分子伴侶改變以及AR 與其他相互通路的串?dāng)_等[13-14]。

本研究結(jié)果顯示:AR-V7 重組載體細(xì)胞的增殖活性顯著升高,提示AR-V7 可以促進(jìn)PCa 細(xì)胞的增殖。與文獻(xiàn)[15]結(jié)論一致。Bryce 等[16]發(fā)現(xiàn)了PCA 通過(guò)激素治療后AR-V7 的陽(yáng)性率和表達(dá)強(qiáng)度明顯升高,其中阿比特龍治療后約55% 的患者可檢測(cè)到AR-V7,苯那魯胺治療后AR-V7 的表達(dá)可從15% 增加到50%。研究者對(duì)AR-V7 進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與普通PCA 相比,CRPC 的AR-V7 表達(dá)水平明顯升高[17]。有研究將PCA 根治術(shù)后患者根據(jù)AR-V7 表達(dá)水平教中位數(shù)水平的高低進(jìn)行了分組,隨訪數(shù)據(jù)顯示,與AR-V7水平高于中位數(shù)的患者相比,AR-V7水平低于中位數(shù)患者的無(wú)進(jìn)展生存率明顯更高[18]。提示,在阻斷雄激素的狀況下,AR-V7 可獨(dú)立激活下游通路,能使AR 信號(hào)通路處于激活狀態(tài),促使腫瘤生長(zhǎng),最終導(dǎo)致患者進(jìn)入去勢(shì)抵抗?fàn)顟B(tài),使疾病進(jìn)一步進(jìn)展,預(yù)后更差。

本研究結(jié)果表明:pIRES2-EGFP-AR-V7 重組載體組p-Akt、p-mTOR 蛋白表達(dá)水平顯著降低,但是AKT 和mTOR 的基因表達(dá)在各組細(xì)胞中沒(méi)有顯著差異,說(shuō)明AR-V7 抑制了AKT 和mTOR 的被磷酸化。AKT 是PI3K 的重要下游靶激酶,AKT 被磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1(phosphoinositide dependent protein kinase-1,PDK1)磷酸化而活化形成p-Akt,后者可以介導(dǎo)下游信號(hào)傳導(dǎo),mTOR 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,是PI3K/Akt 信號(hào)通靶點(diǎn),p-mTOR 由Akt 磷酸化mTOR 形成的,可以促進(jìn)細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)增殖及存活等生理活動(dòng)[19-20]。值得注意的是,在許多實(shí)驗(yàn)中確認(rèn)了PI3K 與AR 通路的串?dāng)_是CRPC 發(fā)生的另外一種機(jī)制[21]。本研究結(jié)果顯示:AR-V7 抑制了AKT 和mTOR 的磷酸化,說(shuō)明AR-V7 與PI3K/AKT 之間存在一定的相互作用,但是AR-V7 是具體怎么調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路的磷酸化,這需要今后進(jìn)一步研究。

綜上所述,AR-V7 基因?qū)CA 細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用,同時(shí)AR-V7抑制了p-Akt及p-mTOR蛋白表達(dá),為CRPC的靶向治療指出了新的方向。

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